裂谷热病毒研究进展

张晨飞，陈昌海，包新奇，董永毅，程 雷，徐正军，徐晓燕，王相子，周 伟，刘耀兴

（江苏省动物疫病预防控制中心，江苏南京 210036）

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）是一类主要感染牛、羊、骆驼等多种动物，并引起病畜死亡、流产的人畜共患病病毒。该病毒可通过与病畜的血液、器官接触以及蚊虫叮咬等途径感染人，但至今未见人与人之间传播的报道。根据国际病毒分类委员会（ICTV）2011年2月最新发表的第九次修改报告，RVFV在分类上属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、白蛉热病毒属（Phlebovirus）。该病毒属目前包括9个病毒成员，分别为Bujaru virus、Candiru virus、 Chilibre virus、 Frijoles virus、 Punta Toro virus、 Rift Valley fever virus、 Salehebad virus、 Sandfly fever Naples virus和Uukuniemi virus。OIE将该病毒引起的裂谷热列为法定呈报传染病（Notifiable disease）。我国目前还未有该类病例发生的确切报道，但2010年9月我国河南、山东等地发生的蜱虫叮咬致死事件，其致病病原被确认为一类新型的布尼亚科病毒，与RVFV的氨基酸同源性30%左右，目前这一病毒被命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）。

RVFV目前仅有一个血清型，具有布尼亚病毒典型的病毒形态和生物学特性。根据该病毒基因组3个节段的比对结果，该病毒被笼统分为North A frica、West A frica、East/Central A frica 3个群[1]，其中最具代表性的病毒株为1977年在埃及分离到的ZH548株，目前该病毒株正被用于开发人兽两用的弱毒活疫苗，MP-12弱毒活疫苗便是由ZH548传代制备[2-3]。

自1930年RVFV被首次分离以来，该病毒已经经历了数次大范围的流行，尤其是70年代以后在人群中几次大流行，造成了严重的人员感染和死亡。鉴于该病毒生物危害性严重，并且近几年时常出现在人群中的大范围流行，有必要对该病毒做一个系统性的了解。本文将从该病毒的基因及蛋白质组学、流行病学特征、国内外流行状况、临床症状和病理变化、疫苗研制及实验室诊断技术等方面对该病毒进行阐述。

1 基因及蛋白质组

布尼亚病毒为单股负链分节段RNA病毒，病毒基因组含3个RNA节段，分别为L、M、S，各节段的末端均含有节段特异的非编码区（UTRs），便于病毒基因组的转录和复制。这些非编码区的末端序列高度保守并互补，能结合核糖核蛋白复合物（RNPs）并形成锅柄样结构（Panhandle structures）。RVFV L和M节段均采取反义编码的形式，而S节段则采用双义编码的策略编码产生N及NSs蛋白。

1.1 L节段 RVFV基因组的L节段长6 406 bp，主要编码大小约237.7 ku的病毒聚合酶，序列比对表明，该聚合酶氨基酸序列末端存在两个新的仅在布尼亚病毒和沙粒病毒的聚合酶中保守的区域[4]。该基因编码的L蛋白是RNA依赖的病毒聚合酶，主要负责病毒基因组的复制和转录[5]，其序列高度保守，具有所有RNA依赖的聚合酶的基序及功能结构域，在白蛉热病毒属的两个成员：RVFV和尤库尼亚米病毒中，L蛋白的同源性高达58%，并且主要集中在RNA依赖的聚合酶的4个结构域中[6]。

1.2 M节段 M节段长3 885 bp，编码4种蛋白，包括节段氨基末端编码的Gn蛋白、羧基末端编码的Gc蛋白，以及非结构蛋白NSm1和NSm2，这些蛋白均由存在重叠编码区的1个ORF编码产生。其中，Gn和Gc蛋白为病毒的囊膜蛋白，主要参与病毒粒子的组装及感染过程。Gn蛋白含有特殊的高尔基体定位基序，能够定位并结合宿主细胞的高尔基体，而Gc蛋白则含有内质网滞留信号（ER retention signal）[7]，在病毒粒子组装时通过与Gn蛋白的相互作用，定位至细胞的高尔基体[8]，参与病毒囊膜的形成。NSm1和NSm2蛋白是病毒基因组M片段在翻译时通过复杂的翻译起始和多聚蛋白加工形成，目前对于其功能还没有明确的定论，但这两种蛋白可能是病毒复制的非必须蛋白[9-10]。

1.3 S节段 S节段长1 690 bp，编码2种蛋白，与病毒基因组其它两个节段的反义编码方式不同，S节段采取双义编码的方式，其中核蛋白N（Nucleoprotein）采用反义编码的方法，而非结构蛋白NSs（Non-structural protein）采用正义编码的方法[11]。核衣壳蛋白N是RVFV病毒粒子中丰度最高的结构蛋白，大量拷贝的N蛋白同病毒基因组RNA相互作用，形成核糖核蛋白复合物，在病毒基因组的转录和复制中发挥重要作用[12]。而NSs蛋白是目前为止研究发现的病毒的主要毒力因子，该蛋白被认为是α和β干扰素的拮抗物，在病毒感染早期通过拮抗宿主细胞产生的α和β干扰素而使病毒顺利得以复制[13]。

2 流行病学特征

裂谷热是一类媒介生物性疾病（Vector-borne disease），主要通过蚊虫叮咬传染，也可以通过接触患病动物的体液及脏器传染。该病宿主范围广，易感动物包括牛、羊、骆驼、马、啮齿动物等。非洲猴类及某些家养肉食动物如狗等常表现为一过性感染。人类是该病的终末宿主，某些职业群体如牧农、屠宰工人、兽医等感染的风险较大。裂谷热的潜伏期一般为2 d～6 d。

裂谷热一般呈现一过性流行或呈现地方流行性，取决于气候、地貌、植被等多种因素。一般在高降雨量的雨林地带，该病呈现地方流行性，而一过性流行多发生于洪水或大量降雨之后，尤其是干旱后的大量降雨，促使蚊虫卵增生，进一步造成该病的发生和流行[14]。

3 国内外流行状况

RVFV首先于1930年在肯尼亚分离获得，目前在多数非洲国家均有发生。上世纪70年代以前，该病毒一直被认为是一类动物病毒，直至70年代后该病毒在非洲国家人群中大范围流行。其主要发生区域及时间为：埃及（1977～1978，1997～1998）、塞内加尔、毛里塔尼亚（1987～1988）、肯尼亚、索马里、坦桑尼亚（1997～1998， 2006 ～2007）、 乍 得 （2004）、 苏 丹 （2008）、 南 非（2010）、阿拉伯半岛（2000～2001）及马约特岛、马达加斯加（2007～2008）。

该病毒主要流行于非洲的大部分国家，唯一非洲以外的流行是2000年～2001年在阿拉伯半岛地区。在沙特阿拉伯，约884人感染该病毒，124人死亡；在也门，约1 087人感染，121人死亡。

4 临床症状及病理变化

4.1 临床症状 裂谷热的临床症状和易感程度因物种和年龄的差异而各有不同。其中，羔羊、幼犬、小猫、小鼠和仓鼠为极易感染动物，病毒对其致死率可达70%～100%。绵羊和犊牛为易感动物，病毒致死率为20%～100%，绵羊感染该病毒后通常呈现41℃～42℃的高热，新生羔羊在高热症状后36 h～40 h死亡。2周龄～13周龄的绵羊少数出现死亡，大多转为轻度感染。怀孕母羊表现出流产症状，流产率5%～100%不等，并且流产母羊死亡率高达20%。13周龄以上成年绵羊仅表现呕吐症状，但所有年龄阶层绵羊均可能出现高热、精神沉郁、出血性腹泻、鼻腔出血性粘液分泌物、黄疸等症状。成年山羊表现为轻度感染，母羊流产率高达80%，但死亡率较低。犊牛感染RVFV后通常表现为精神萎靡、食欲不振，伴随高热、腹泻、呼吸困难、黄疸等症状。成年牛通常表现为隐性感染，偶有实质性症状，表现为一过性发热，高热时间通常持续24 h～96 h不等，反应迟钝、流泪、流延、厌食、精神萎靡、偶尔伴有出血、腹泻等症状。奶牛表现为产奶下降，怀孕母牛流产率可达85%，死亡率10%～15%[15]。

人感染RVFV后多数表现为轻度感染症状，出现发热、呕吐、腹泻等肝炎症状。重症患者可表现3种临床症状[15-16]。

4.1.1 黄斑状视网膜炎（Maculo-retinitis）出现这种疾病反应时，与轻度疾病反应有联系的通常症状伴有视网膜病变。通常是最初症状出现1周～3周后眼睛就出现病变。患者往往自述视力模糊或视力下降。疾患可能在10周～12周内自愈，不产生任何长期的影响。不过，如果黄斑发生病变，50%的患者将会永久性失明。

4.1.2 脑膜炎症状该病出现脑膜炎症状往往是在最初裂谷热症状出现1周～4周之后。临床特点包括剧烈头痛、失去记忆、出现幻觉、思维混乱、定向障碍、眩晕、惊厥、嗜睡和昏迷。随后可能出现神经系统并发症（>60 d）。仅患该病症的患者，其剩余的神经功能缺损很常见，病情可能会很严重，死亡率不高，但会导致严重的后遗症。

4.1.3 出血热症状这种疾病症状造成的后果最为严重，通常在发病2 d～4 d后出现，开始有严重肝损伤的迹象，比如黄疸。随后则有出血征兆，如呕血、便血、紫癜皮疹或瘀斑（皮肤出血所致）、鼻孔或牙龈出血、月经过多以及静脉穿刺部位出血。有出血热症状的患者，其病例致死率很高，约为50%。死亡往往发生在出现症状3 d～6 d后。裂谷热患者若有出血性黄疸症状，10 d后血液中仍可检出病毒。

4.2 病理变化 剖检表现为肝脏肿胀、充血、表面呈点状或弥散性坏死，形成单个直径1 mm左右的点状坏死灶，流产胎儿肝脏呈黄褐色。皮肤大范围出血，腹壁及内脏浆膜出现瘀斑。淋巴结肿大、出血、坏死，肾脏、胆囊充血并伴有皮质出血，肠道出血，犊牛多出现黄疸。临床诊断时，裂谷热需要与其它能够引发流产、肝炎、出血热的疾病鉴别，如流感、流行性乙型脑炎、病毒性肝炎、蓝舌病以及布鲁氏菌病和Q热等。

5 疫苗研制

目前，国际上还没有预防裂谷热的商品化疫苗，该病的疫苗仍处于研制阶段。研究表明，体液免疫能够很好的保护机体免受RVFV的侵染[17]，此外被动的摄入针对该病毒的中和抗体，也能够达到很好的保护效果[18]，据此，国际上对于裂谷热疫苗的研制存在一个共识，即针对已知的RVFV株，开发能够刺激机体快速发生体液免疫反应，产生中和抗体并提供长期免疫保护的疫苗。目前，处于研制阶段的裂谷热疫苗大致有3类，包括灭活苗、弱毒活疫苗以及重组蛋白苗：

5.1 灭活苗 代表疫苗株为NDBR 103，是由Entebbe病毒株在小鼠体内184次传代，并在非洲绿猴肾细胞（A frican green monkey kidney cells，Vero）上进行扩增，最后通过福尔马林灭活获得。

5.2 弱毒活疫苗 代表疫苗株为MP-12，是由从一名埃及患者身上分离获得的ZH548野生病毒株，在乳鼠体内传代两次，在恒河猴肺细胞（Foetal rhesus monkey lung cells，FRL）细胞上传代1次，最后通过5-氟尿嘧啶压力选择，在人类胚胎肺细胞（Human lung embryonal fibroblast cells，MRC-5 cells）传代12次获得[2]。该疫苗株是目前研制较为成功的疫苗之一，为人兽通用疫苗，目前该疫苗已进入2期临床实验阶段。

5.3 重组蛋白疫苗 该类疫苗目前仍处于研制起始阶段，所针对的抗原主要是RVFV的囊膜蛋白Gn/Gc，其中Gc蛋白存在3个中和表位，被认为是RVFV的主要抗原表位[19]，通过免疫重组表达Gn/Gc蛋白，动物机体能够产生针对RVFV的中和抗体。

6 实验室诊断技术

6.1 病原学检测

6.1.1 病毒分离RVFV的分离是鉴定该病毒的金标准，病毒可以通过脑内或腹腔接种乳鼠获得，也可通过在Vero、BHK21以及一些蚊虫细胞系上的分离培养获得。通过细胞分离培养分离病毒时，需要出现RVFV的特征性细胞病变后才能收获病毒，通常情况是在接种后的5 d～6 d，感染细胞在边缘部分出现轻微病变，而后12 h～24 h内所有细胞崩解死亡。根据接种的病毒株毒力强弱以及原液接种量的多少，扩增病毒所需的传代次数以及收获时间也不相同。病毒扩增后可通过免疫荧光、RT-PCR、病毒中和试验或病毒基因测序的方法进行鉴定，相关标准参照OIE《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》 2009版（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2009）。

6.1.2 分子诊断技术

6.1.2.1 常规RT-PCR：目前针对RVFV检测的RT-PCR检测方法很多，主要针对NSs、Gn/Gc编码区，与病毒分离鉴定和ELISA比较，RT-PCR检测灵敏度高、耗时短、安全性高，并且不存在ELISA检测的交叉反应，特异性高，可用于病毒感染早期的检测。此外，由于RT-PCR检测灵敏度高，最低检出灵敏度可达50 PFU左右，该技术还被用于检测蚊虫等媒介携带的病毒，最低检测量相当于1/16 000只蚊子[20-23]。

Yeh等在常规RT-PCR技术的基础上研发了一种针对RVFV、蓝舌病病毒（Bluetongue virus）、牛瘟病毒（Rinderpestvirus）以及小反刍兽病毒（Peste des petits rum inants virus）鉴别检测的多重RT-PCR，能够用于上述病毒感染的早期诊断和鉴别诊断，大大方便了RVFV的实验室诊断[24]。

6.1.2.2 荧光定量RT-PCR：该方法能在病毒感染后的1 d～4 d，先于RVFV感染症状及机体产生抗体之前检测出病毒，根据引物设计策略的不同，该技术最低检测量可低至5个模板RNA的拷贝数（相当于0.1 PFU）到30个模板RNA的拷贝数[25-26]，提高了RVFV快速检测的效率。

6.1.2.3 套式RT-PCR：针对病毒NSs蛋白编码基因建立的套式RT-PCR，灵敏度介于常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR之间，能够达到0.5 PFU的最低检出量[22]。

6.1.2.4 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）：该技术的最大优势在于不需要精密的分子仪器，可以在一般的实验中进行检测，同时具有较高的特异性，对于裂谷热高发的非洲国家而言，是一类较为实用的检测方法[27]。

6.1.3 其它诊断方法主要指针对RVFV全病毒抗原或病毒主要结构蛋白、致病力蛋白如N蛋白、NSs蛋白等制备高特异性、高亲和力的多克隆或单克隆抗体，建立ELISA、IFA、AGID、免疫组化等方法检测RVFV抗原。

肝脏是RVFV感染后的主要病变器官，研究表明，几乎所有感染RVFV死亡的新生羔羊，肝脏均受到病毒的侵染并出现显著的病理变化，提示RVFV感染具有明显的嗜肝脏性，利用免疫组化法检测时，可以观察到典型的组织病理变化，并且利用该方法检测时，肝脏可以用甲醛固定，不受送检时间限制，所以免疫组化法目前仍是检测RVFV较为重要的方法之一。目前，多数检测RVFV抗原的ELISA方法主要是针对N蛋白，该蛋白在RVFV感染时，表达丰度高，保守性强，并且作为病毒主要的结构蛋白，N蛋白在病毒感染初期便能被检测到，是针对RVFV快速诊断的主要抗原蛋白[28]。

6.2 血清学诊断 病毒中和试验、ELISA、HI试验是目前RVFV抗体检测较常用的方法，其他如AGID、IFA、放射免疫分析、补体结合试验等也可用于检测RVFV抗体，但应用较少。以下仅介绍实验室检测常用的ELISA方法的研究状况。

近年来RVFV抗体检测的ELISA技术发展较快，已经研发出多种类型的ELISA方法[29-30]，以及针对不同抗体类型的检测方法，其原先所用的灭活病毒抗原也逐渐被重组N蛋白替代。该方法灵敏度高、检测量大，是抗体监测和疫病诊断的最佳选择。

6.2.1 检测IgG的间接ELISA（致弱病毒为抗原）以γ射线辐射致弱病毒为抗原建立的针对人IgG检测的间接ELISA，其灵敏度和特异性在特定临界值时能分别达到100%和99.95%，超越了传统的病毒中和试验，在不久的将来可能替代中和试验，用来评价疫苗效率[31]。

6.2.2 检测IgM的捕获ELISA（致弱病毒为抗原）以γ射线辐射致弱毒为抗原建立的针对人IgM检测的捕获ELISA，特定临界值时灵敏度和特异性分别达到96.47%和99.44%。IgM是病毒感染或疫苗免疫后动物机体最先出现的免疫球蛋白类型，所以针对IgM的检测可能比检测IgG更快速[31]。

6.2.3 检测IgG、IgM的间接ELISA以重组N蛋白为抗原建立的针对人或羊IgG及IgM检测的间接ELISA，能够分别在人工感染后4 d～5 d和3 d～4 d进行抗体检测，在用于病毒感染早期检测时，其敏感度高于病毒中和试验和 HI试验[32]。

7 小结

作为虫媒病毒的一种，RVFV的发生和流行存在较大的地域和气候因素，并且主要以地方流行性为主，由于能通过蚊虫垂直传播，该病毒的地方流行可以伴随气候或雨季的变化周而复始的发生，使得防控工作难以进行。有证据显示，近年来RVFV的发生和流行正在改变其传统的本土流行的模式，呈现向非洲以外地区传播的趋势，毛里塔尼亚、埃及、苏丹等地区的流行就是很好的证明。尽管目前RVFV向非洲以外传播的原因不明，但我们不能排除该病毒通过气候转移、游客或生奶奶源向欧洲、亚洲或美洲国家传播的可能性[33-34]。加之目前国际上还没有可用的人用或兽用疫苗，使得RVFV的预防和控制显得尤为严峻，做好气候预警[35]和疫苗研发[36-37]可能是今后几年RVFV防控的关键突破点。

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