三氧化二砷诱导乳腺癌细胞株MCF-7凋亡对端粒酶活性的影响

陈智嘉，谷 励，王景龙，陈思嘉

(1.吉林大学白求恩医学院药理学系，吉林长春 130021;2.吉林省临江市医院，吉林 临 江 134600;3.军事医学科学院11所，吉林 长春 130122)

乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，近年发病率逐年上升，且发病年龄也趋于年轻化。近年来研究发现As2O3不仅对APL细胞，而且对其他血液肿瘤细胞［1－2］和许多实体瘤细胞均具有诱导凋亡作用［3－4］。Wang 等［5］研究表明端粒酶与恶性肿瘤发生有着紧密的关联，p21特异性核苷酸序列能够抑制端粒酶的活性，诱导肿瘤细胞凋亡。也许端粒酶的活性指标在治疗恶性肿瘤的过程能提供新的策略。

本实验对As2O3对乳腺癌细胞的抑制作用及在不同浓度下端粒酶活性的变化进行了研究。以期为治疗乳腺癌的过程中提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与细胞株 纯试剂As2O3购自美国Sigma公司，配成(1 mmol·L－1)，溶于 PBS 液，冻存;RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、胰酶实验耗材等购自Gibco公司;DMSO(生工生物);RT-PCR kit宝生物工程(大连)有限公司;其他试剂均由吉林大学白求恩医学院药理学实验室提供。人乳腺癌细胞MCF-7株购自中科院上海细胞生物学研究所，本室自己传代保存。

1.2 细胞培养 细胞培养细胞采用开放式单层贴壁培养，培养液为RPMI 1640(含10%小牛血清，青霉素100 kU·L－1，链霉素 1 00 mg·L－1)，培养条件为 3 7℃，5%CO2，相对饱和湿度。每日观察生长情况，贴壁2～5 d传代1次。传代时用0.25%胰酶消化后，加入培养液吹打制成细胞悬液，继续传代，并取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法 取对数生长期的MCF-7细胞系，制成每升约含有1×108个单细胞悬液。分别接种于96孔板，每孔加细胞悬液100 μl，置37℃、5%CO2培养箱中24 h后。将实验分6组即对照组和5给药组，按分组情况分别加入(0.5，0.8，1.0，1.5 和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每个浓度设 5 个复孔，每孔终体积200 μl，培养48 h后，每孔加入50 μl MTT继续培养4 h，吸弃培养液，每孔加入100 μl DMSO，充分振荡10 min，于酶标仪上检测490 nm处吸光度值。计算细胞成活率/%=(实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。

1.4 抑制端粒末端转移酶的活性 依据PCR-ELISA方法平均值来测定端粒末端转移酶的活性，首先培养收集对数生长期的MCF-7细胞系加入终浓度分别为(0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 μmol·L－1)的 A s2O3，每个浓度设 5 个复孔，培养 2 4 h后进行裂解细胞通过PCR-ELISA方法测定其平均值。同时加入1.5 μmol·L－1的 A s2O3后分别培养24、48 和72 h 后测定其平均值。

2 结果

2.1 MTT比色法测定As2O3对细胞存活率的影响 通过MTT法测定发现:与对照组比，给药组的细胞存活率随着As2O3的浓度的增加明显呈现剂量依赖性降低。其中给药浓度为2.0 μmol·L－1，细胞的存活率为(41.69 ± 0 .25)%(P＜0.01)差异具有统计学意义。可以作为抑制癌细胞增殖的参考数据。

2.2 端粒酶活性的变化 端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核酸蛋白酶，通过延长端粒DNA从而阻滞因端粒酶缩短而诱发的细胞衰老，使细胞具有无限增殖能力。因此，端粒酶与肿瘤的恶性进展密切相关。按照说明书进行端粒酶活性检测，在酶标仪中得到端粒酶的OD值，根据标准品的OD值应用SPSS13.0软件进行统计学分析。与对照组组相比，当 As2O3达到 1.5、2.0 μmol·L－1时，差异有统计学意义(P=0.000)。当 As2O3浓度为1.5 mmol·L－1，时间达72 h时As2O3抑制端粒酶的活性经PCR-ELISA方法检测均具有时间－浓度的依赖性结果，差异具有统计学意义。

3 讨论

As2O3作为我国传统中药，在治疗急性早幼粒细胞白血病过程取得了明显的疗效。近年来研究表明As2O3能够诱导多种癌细胞的凋亡，诸如急性早幼粒白细胞、骨髓癌细胞、神经瘤细胞、食道癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、恶性肾肿瘤细胞、卵巢癌细胞、喉癌细胞。对(1)通过MTT法测定As2O3对细胞存活率的影响;(2)通过PCR-ELISA方法测定端粒酶活性的变化;端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核酸蛋白酶，能在多种肿瘤中高表达，而在良性和正常组织中低表达，是肿瘤预后和重要的抗肿瘤靶点［6］。据最近研究报道端粒酶在不同的细胞周期阶段发挥着重要的作用，尤其在细胞G0/G1活性明显增强［7］。通过用PCR-ELISA法测定经As2O3处理过的乳腺癌细胞端粒酶活性的变化，我们发现随着As2O3的浓度和反应时间上的不断增加，端粒酶的活性不断降低。因此推断As2O3能抑制乳腺癌细胞端粒酶活性在时间－浓度均呈依赖性，这为As2O3在治疗乳腺癌的实践中提供理论依据。

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