王 磊,辛文锋,张文生
(1.北京师范大学地表过程与资源生态国家重点实验室,2.中药资源保护与利用北京市重点实验室,
3.教育部资源药物工程研究中心,北京 100875;4.云南省三七生物技术与制药工程研究中心,云南 昆明 650000)
阿尔采末病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性的中枢神经系统退行性疾病,临床表现为认知和记忆功能障碍、精神行为异常及生活能力进行性减退[1]。脑组织中典型的病理改变包括细胞外由 β-淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SPs)、细胞内过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、胆碱能神经元凋亡和突触丢失[2],Aβ 产生相关酶的抑制剂、抗氧化剂、钙离子拮抗剂、非甾体类抗炎药、降胆固醇药物、雌激素类药物对AD的治疗也有良好效果。栀子是茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实,具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效。栀子苷(geniposide)属于环烯醚萜苷类化合物,经β-葡萄糖苷酶水解后,可得其苷元京尼平(genipin)。栀子苷和京尼平具有多种药理活性,包括抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗血栓、保肝利胆等。近年来研究表明栀子苷和京尼平对AD具有良好的治疗作用。动物实验证实栀子苷明显提高AD模型动物的学习记忆能力,改善认知功能状态;细胞实验发现栀子苷和京尼平均具有保护神经细胞抵抗Aβ毒性损伤作用、抗氧化应激、抗内质网应激、抗炎症反应及促进神经细胞生长等作用。随着研究的逐渐深入,阐释其作用的分子机制成为研究的热点。本文对近年来栀子苷和京尼平治疗AD的有关文献进行总结,为进一步深入研究提供思路。
老年斑是AD的主要病理标志,其核心成分是Aβ。Aβ由存在于细胞膜上的淀粉样前体蛋白(APP)经β分泌酶和γ分泌酶水解产生的39~43个氨基酸的多肽片段,主要有Aβ1-40和Aβ1-42两种形式,可自发聚集成可溶的寡聚态和不可溶的纤维态,纤维态的Aβ在神经细胞外沉积构成老年斑。Aβ具有神经毒性,可引起神经细胞凋亡,且不同形式的Aβ中寡聚态的毒性最强。栀子苷水溶性较好,能够顺利透过血脑屏障,是发挥神经保护作用的基础。在脑室内注射寡聚态Aβ25-35致痴呆小鼠模型中,连续14 d灌胃给予栀子提取物能够缩短痴呆小鼠在Morris水迷宫实验中的寻台潜伏期,明显提高痴呆小鼠的空间学习记忆能力[3]。另外,栀子苷对Aβ42转基因果蝇的短时记忆也有明显的改善作用,保护过量产生的Aβ1-42对神经细胞的损伤[4]。进一步实验证明栀子苷和京尼平明显改善Aβ对体外培养大鼠海马神经细胞的毒性损伤,剂量依赖性改善细胞形态,减少乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的漏出,40 μmol·L-1的京尼平可使LDH漏出率降低50%[5]。有研究表明京尼平能够抑制caspase级联反应和线粒体损伤[6],还可通过活化MAPK信号通路发挥抗凋亡作用,对抗Aβ造成的毒性反应。
神经系统对氧的消耗大,且抗氧化机制薄弱,对氧化应激十分敏感。在AD患者脑组织神经元中存在明显的氧化应激反应,主要表现为大量自由基的产生(包括超氧阴离子)、羟自由基(HO·)、H2O2和活性氮(ONOO-)),脂质、蛋白质和核酸的过氧化,抗氧化酶活性降低以及线粒体功能的损伤,并伴随线粒体介导的细胞凋亡。该凋亡通路通过引起细胞色素C的释放,活化caspase-9,启动下游的凋亡级联反应。
栀子苷和京尼平具有多重的抗氧化应激和保护线粒体的作用。主要表现在:①体外实验发现栀子苷能够捕获自由基。利用DPPH抗氧化活性体外评价体系研究发现,栀子苷对DPPH具有微弱的清除作用[7]。② 京 尼平具有抗脂质过氧化的作用,对Fe2+/抗坏血酸引起的大鼠脑组织匀浆脂质过氧化有剂量依赖的抑制效果[8]。③ 栀 子苷通过Ras/Raf/MEK-1/Erk信号通路,促进谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)M1亚基和 M 2亚基的表达,提高GST的活性[9-10]。GST是体内重要的解毒酶系,催化还原型谷胱甘肽与亲电子类物质结合,保护脂质、蛋白和核酸等免受氧化损伤[11]。④ 栀子苷激活胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1,GLP-1R),促进 cAMP 产生,分别活化下游的 MAPK-p90RSK[12]、PI3K/Akt-Nrf2[13-14]和 PKACREB[15]信号通路,提高血红素氧化酶(hemeoxygenase,HO-1)的表达,抵抗H2O2和ONOO-供体(SIN-1)导致的神经细胞氧化损伤。又有实验证实栀子苷预处理对CoCl2引起的氧化应激有改善作用。栀子苷既能上调抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,又能下调凋亡蛋白Bax、转录因子p53的水平,直接阻断线粒体介导的细胞凋亡通路[16]。⑤ 栀子苷和京尼平都能结合并活化神经型一氧化氮合酶(neuronal NO synthase,nNOS),促进细胞中 NO 的产生[17],通过激活 cGMP 依赖的PI3 kinase/Akt通路,减少线粒体细胞色素C释放,阻断凋亡通路中caspase-3和caspase-9活化,抑制6-羟多巴胺和H2O2对神经细胞的氧化损伤[18-19]。
内质网是负责细胞蛋白合成、翻译后加工修饰及正确折叠的细胞器,也是储存Ca2+的主要场所,内质网中含有大量Ca2+依赖的分子伴侣蛋白和相关酶类。在AD病理状况下,内质网中Ca2+流入胞质,Ca2+耗竭影响分子伴侣蛋白的正常功能,加速错误蛋白的积累;胞质中过量的Ca2+可激活钙蛋白酶,进而活化caspase-12引起细胞凋亡。内质网应激还能引起线粒体细胞色素C的释放和跨膜电位的消失,诱导氧化应激及线粒体损伤。目前尚无栀子苷和京尼平对Aβ所致内质网应激的直接实验证据,但是京尼平对衣霉素[20]及A23187[21]引起的Neuro2a细胞内质网应激具有明显的保护作用。京尼平(20 μmol·L-1)能够降低内质网应激分子伴侣Bip/GRP78,CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA及蛋白水平,还能抑制凋亡通路中caspase-12和caspase-3/7的活化,抵抗内质网应激造成的神经细胞凋亡。
栀子是常用的抗炎中药。栀子苷和京尼平对多种外周组织炎症模型(如组织创伤、细菌感染、类风湿性关节炎等)具有治疗效果[22-24]。两者不但能够减少炎症早期的水肿和渗出,还能抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成,对炎症因子和炎症酶的表达也有明显的抑制作用。栀子苷对中枢神经系统损伤模型(如局灶性脑缺血模型[25]、脑出血模型[26])的炎症反应也有明显的改善作用,主要表现在抑制转录因子 NF-κB 活化,减少炎症因子(TNF-α、IL-1β)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)和趋化因子MCP-1等的表达。
AD患者脑组织中存在着明显的慢性炎症反应,Aβ能够激活星形胶质细胞和小胶质细胞,改变胶质细胞形态,并诱导大量炎症介质(如细胞因子、黏附分子、趋化因子、急性期蛋白和补体等)的产生;炎症介质直接损伤神经细胞,并促进Aβ 的产生,形成恶性的负反馈环路[27]。Nam 等[28]证明京尼平能够明显抑制寡聚态Aβ25-35诱导的小胶质细胞活化,推测其有可能通过抗炎机制发挥治疗AD的作用,具体作用机制尚不清楚。进一步研究发现Aβ结合小胶质细胞膜上的受体RAGE[29],活化胞内信号转导通路,引起 NF-κB入核,促进 TNF-α、IL-1β、ICAM-1、COX-2、iNOS 和 RAGE 本身的表达,扩大炎症信号[30],因此RAGE是一个值得关注的靶点。
大脑皮层前额叶以及颞叶下侧的海马和基底核是人脑学习记忆的主要脑区,AD发病过程中胆碱能神经元突触丢失及细胞凋亡会导致突触间信号传递效率降低,影响学习记忆能力。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)主要与细胞膜上的受体酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)结合,启动TrkARas-ERK胞内信号通路[31],也能诱导细胞内nNOS的活化,启动NO-cGMP-PKG通路,促进胆碱能细胞生长和突触重建[32]。栀子苷和京尼平也有促神经细胞生长作用。PC12h细胞经0.1 mg·L-1和10 mg·L-1的栀子苷和京尼平处理3天,神经突起明显延长。5 mg·L-1组京尼平的作用效果接近于0.1 mg·L-1NGF[33]。利用一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis,NOS)抑制剂、一氧化氮捕获剂、可溶型鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,SGC)抑制剂、PKG(cGMP-dependent kinase)抑制剂、ERK(extracellular signal-regulated kinase)抑制剂都能抑制京尼平的作用,证明NOS-NO-cGMPPKG-ERK是京尼平促进神经生长的主要通路[34-35];体外实验证明PC12h细胞胞质中的nNOS能与栀子苷及京尼平特异结合,并被剂量依赖地活化,是两者的共同作用位点[17]。因此栀子苷和京尼平通过激活nNOS,活化NO-cGMP-PKGERK 信号通路[34-35],促进神经生长。
进一步研究表明,栀子苷和京尼平的作用机制并不完全相同。PC12细胞与PC12h细胞具有相同的来源,但正常PC12细胞中没有nNOS。经栀子苷和京尼平处理后,前者能够促进PC12细胞生长,但后者则无此作用[36],表明nNOS是栀子苷和京尼平的共同结合与活化靶点,而栀子苷还具有除nNOS以外的其他作用靶点。
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)及类似物extendin-4能够活化PC12细胞膜上的 GLP-1R,促进PC12细胞突触生长[37]。已经证实栀子苷是GLP-1R的新型激动剂,能够活化GLP-1R及下游的MAPK信号通路,提高生长相关蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)的表达,促进PC12细胞生长[38]。因此在缺乏nNOS的神经细胞中,栀子苷还能通过激活GLP-1R而发挥作用,反映了栀子苷与京尼平作用的不同之处,推测与二者的结构差异有关。
综合上述,栀子苷及京尼平在对抗Aβ毒性作用、抗氧化应激、抗内质网应激及抗炎等多方面具有良好效果,并能促进神经生长,修复受损神经元。作为一味传统的清热解毒中药,栀子对AD有较好的抗炎治疗效果,其抗炎的靶点和分子机制有待深入研究。
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