凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导通路研究进展

石 鑫 宋 丽 苏 琦 刘雅文程 熠

(吉林大学白求恩第一医院心血管诊治中心，吉林 长春 130021)

凝血酶与血小板上凝血酶受体结合，是血小板激活信号转导的重要环节〔1，2〕。凝血酶受体包括:蛋白酶激活受体1(protease-activated receptor 1，PAR1)、PAR4〔3〕和血小板糖蛋白 IbⅨ-Ⅴ(GPIb-Ⅸ-Ⅴ)复合体。GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体是表达在血小板膜表面的膜受体，凝血酶高亲和力结合位点位于GPIbα上，凝血酶与GPIbα结合可促进血小板对低浓度凝血酶的反应〔4〕。研究凝血酶与血小板上凝血酶受体的相互作用，以及凝血酶诱导的血小板激活过程对于深入了解止血及血栓形成和血栓疾病的发病机制有极其重要的意义。

1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体与凝血酶结构

1.1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体的结构 每个血小板上大约有25000个GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体。血小板GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体由四种不同的多肽链构成，分别为GPIbα，GPIbβ(GPIbα与GPIbβ通过二硫键共价连接)，GPIX，GPV。GPIb，GPIX，GPV 的分子数之比为 2∶2∶1〔5〕。

1.2 凝血酶的结构 凝血酶是在凝血瀑布级联反应中重要的蛋白酶，它既可将血液循环中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，又是血小板活化的强效激动剂〔1，6〕。凝血酶由一个含36个残基的A链和一个含259个残基的B链组成。凝血酶包含一个催化活性位点及二个识别结构域(exositeⅠ和exositeⅡ)〔7〕。凝血酶的exositeⅠ和exositeⅡ都是血小板 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体GPIbα亚基的作用位点。凝血酶exositeⅠ与GPIbα可能存在较弱的作用。水蛭素通过竞争凝血酶exositeⅠ，抑制凝血酶与GPIb的结合，化学修饰或用水蛭素封闭exositeⅠ可降低凝血酶诱导的血小板5-羟色胺释放及聚集〔8〕。然而，由于对exositeⅠ定点突变研究较少，exositeⅠ与GPIbα的相互作用尚待进一步研究。肝素和凝血酶原片段2可与exositeⅡ结合，它们干扰凝血酶与血小板GPIbα的结合〔9〕;加之，凝血酶exositeⅡ突变体降低凝血酶与GPIb结合，这些都表明exositeⅡ是凝血酶识别GPIb的重要结构域。

1.3 GPIbα 与凝血酶复合体的结构 Celikel〔10〕和 Dumas等〔11〕研究了GPIbα片段和凝血酶复合体的晶体结构。GPIbα-凝血酶复合体主要以1∶1形式存在，但双方在凝血酶exosites和GPIbα之间的相互作用的认识存在差异。Dumas等人认为凝血酶exositeⅠ的相互作用主要是极性的，而Celikel等则认为是疏水作用。在Celikel等研究的结构中，exositeⅠ的相互作用包括GPIbα的硫酸化酪氨酸，而在Dumas等研究的结构中并不包括。此外，双方关于主体GPIbα的阴离子区的位置却是完全不同的。不过，双方都认为GPIbα阴离子区和凝血酶exositeⅡ之间存在较强的相互作用。GPIbα的Tyr276-Tyr279序列都与凝血酶exositeⅡ相互作用，Leu275在定位硫酸化Tyr276的侧链起作用。定点突变研究发现:GPIbα的Leu275-Tyr279序列与exositeⅡ中6个氨基酸残基中的5个相互作用。

当几个凝血酶分子结合到多聚纤维蛋白表面，凝血酶exositeⅠ和exositeⅡ交替与GPIbα相互作用促使GPIbα发生交联。对应GPIbα Tyr276-Tyr279区外的多肽能够阻止GPIbα受体交联，但不能通过凝血酶exositeⅡ抑制GPIbα与凝血酶的相互作用，这正是这些多肽不能抑制凝血酶的结合但能抑制血小板聚集的原因，敲除GPV可促进GPIbα二聚体化〔12〕。由此可见，GPIbα的交联是由凝血酶和GPIbα相互作用引起信号转导所必需。

2 凝血酶与GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体的相互作用

2.1 凝血酶与GPV的相互作用 GPV是血小板表面的凝血酶底物〔13〕，是凝血酶诱导的血小板激活的重要调控因子〔14〕，在凝血酶诱导的血小板聚集的早期，凝血酶切割GPV链Arg460和Gly461〔15〕，凝血酶诱导的血小板最大激活常伴随＞1%的GPV水解〔16〕。

2.2 凝血酶与GPIbα的相互作用 GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体的配体结合区主要位于GPIbα链的N-末端的球状区，这是通过GPIbα合成肽、蛋白水解片段及定点突变体证实的。对应GPIbα负电荷区域的多肽不但会抑制凝血酶结合，也会抑制凝血酶诱导的血小板聚集。对应GPIbα负电荷区域的上游区域(Phe247-Thr265)的多肽也会抑制GPIbα与凝血酶结合，尽管程度会低一些;然而，这种多肽对凝血酶诱导的血小板聚集无影响。GPIbα的Phe216-Thr240残基组成的多肽可抑制凝血酶诱导的血小板聚集，但不会抑制凝血酶与GPIbα结合。因此，GPIbα的负电荷区域是凝血酶的结合位点〔17〕。

GPIbα的负电荷区域包含三个硫酸化的酪氨酸残基(Tyr276，Tyr278，Tyr279)，酪氨酸残基的硫酸化是 GPIbα 与凝血酶相互作用的基础。加之，水蛭素、凝血因子V及纤维蛋白的酪氨酸硫酸化也有利于它们与凝血酶结合。这提示，凝血酶倾向与酪氨酸残基硫酸化的蛋白相互作用。

2.3 少于5%的GPIbα受体结合凝血酶 凝血酶与GPIbα结合是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导的前提，然而只有少于5%的GPIbα受体结合凝血酶。研究发现:部分GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体位于脂筏上，脂筏的破坏导致无催化活性的凝血酶诱导的GPIb介导的血小板的黏附急剧减少〔18〕。胆固醇的存在和受体簇集是脂筏的两大特征。通过增加胆固醇的富集及减少胆固醇消耗，血小板上凝血酶的高亲和位点数增加;GPIbα受体交联体现脂筏信号转导的受体簇集特性，GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体是否定位于脂筏是GPIbα受体交联和凝血酶信号转导的必要条件。这可能是只有少于5%的GPIbα受体在血小板膜上是凝血酶高亲和力受体的原因〔19〕。

此外，GPIbα胞质尾部通过细丝蛋白与血小板膜骨架连结，对GPIb-VWF相互作用有很强的负调节作用〔20〕。因此，游离的GPIbα和与血小板膜骨架连结的GPIbα的比例，也为为什么只有少于5%的GPIbα受体在血小板膜上是凝血酶高亲和力受体，提供了另一种解释。但目前尚缺文献的进一步证实。

3 GPIbα介导的血小板凝血酶信号转导通路

3.1 凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导通路的证实 在低浓度凝血酶的条件下，凝血酶诱导的血小板活化依赖GPIbα。Ramakrishnan等〔16〕使用敲除GPV的鼠血小板和用蛋白酶酶解消除GPV的人血小板，发现:即使GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体中没有GPV的存在，无催化活性的凝血酶仍能诱导血小板的信号，导致血小板的聚集。Soslau等〔21〕研究发现在PAR1失敏的情况下，凝血酶依赖于GPIbα并利用纤维蛋白发挥作用，诱导血小板激活。上述研究结果进一步印证了GPIbα与凝血酶相互作用引发的血小板激活信号转导通路的存在。

3.2 GPIbα介导的血小板凝血酶信号转导 使用无催化活性的凝血酶可以研究依赖GPIb而独立于PAR的信号转导通路。在这种情况下，血小板黏附，致密颗粒分泌，整合素αIIbβ3依赖血小板相互作用伴随ADP分泌而同时发生。分泌的ADP在GPIb介导的血小板活化的过程中起着主要的作用，而环腺苷酸(cyclic AMP，cAMP)的浓度又可调节GPIb介导的血小板活化。参与这一信号转导的激酶包括:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Src 家族激酶(Src family kinases，SFKs)和蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)〔22〕。使用 PI3K和PKC抑制剂抑制血小板相互作用和蛋白酪氨酸磷酸化的结果表明:PKC的激活是GPIb介导的血小板凝血酶信号转导通路的重要环节。Dubois等〔23〕研究表明在PAR1和PAR4失敏的情况下，凝血酶和GPIbα结合也可引起纤维蛋白依赖的血小板聚集，这一过程涉及Rho激酶(Rho kinase)和p160 Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(p160 Rho associated coiledcoil forming protein kinase，p160ROCK)的激活，丝裂原活化蛋白激酶激酶-1(mitogen-activated protein kinase kinase1，MEK-1)磷酸化和踝蛋白(talin)切割。

4 GPIbα与其它受体的相互作用

GPIbα与其它受体的相互作用也是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导的重要组成。由于蛋白酶酶解消化的血小板或巨大血小板综合征〔24〕患者的血小板，缺少GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体或具有丧失功能的GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体，这些血小板都不能与低浓度凝血酶反应。加之，GPIbα与凝血酶的结合先于凝血酶对PAR1的水解〔25〕。Furman等〔26〕研究还发现 PAR1的41个氨基酸裂解肽(TR1-41)可引起从血小板表面到表面连接的小管系统GPIb、GPIX、GPV的重分配，从而负调节血管性血友病因子(VWF)和凝血酶与GPIbα结合位点。Lova等〔27〕研究表明凝血酶或选择性激活肽激活PAR1和PAR4，刺激磷脂酶C、酪氨酸激酶和小GTP酶Rap1b，可促进肌动蛋白聚合和细胞骨架重组。但是当血小板PAR1和PAR4失敏时，高浓度的凝血酶不能激活Rap1b，但可激活磷脂酶C。一旦金属蛋白酶mocarhagin水解GPIbα，这些事件将被中止。这提示，GPIbα对凝血酶激活PAR具有辅助作用。

此外，Sun等〔28〕通过使用酵母双杂交系统和诱变因素发现GPIbα和FcγⅡA受体可相互作用，GPIbα残基 Arg542Gly543Arg544与FcγⅡA受体Asp298Asp299Asp300是主要的相互作用位点，并证实GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化的信号转导通路部分是通过FcγⅡA受体介导。

5 结语

越来越多的证据表明GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体是凝血酶受体，凝血酶与GPIbα相互作用、GPIbα受体交联等凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导通路研究已取得长足的进展。此外，GPIbα与其它受体相互作用提示GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化信号转导通路的复杂性。清楚阐释凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导通路和血小板活化，将为预防和深入认识老年血栓疾病奠定基础，因此凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受体信号转导通路有待于进一步研究。

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