HIV实验室检验技术及效果分析进展

黄 雁 陈兴智

（1北海市中心血站质量管理科，广西 北海 536000，2 广西血液中心业务科，广西 柳州 545005）

艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（humanimmnuodeficienc yvirus，HIV）感染所引起的一种严重的传染病。艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（humanimmnuodeficiencyvirus，HIV）感染所引起的一种严重的传染病。HIV至今尚无有效的预防疫苗及根治药物，如何做到早发现、早治疗是预防和控制AIDS最有效的措施，最大程度地减少HIV对社会的危害，是我们的责任。而输血是HIV传播的重要途径之一，WHO全球艾滋病项目《安全血液和血制品》指出，确保血液安全一个重要措施是排除高危人群，从低危人群中招募献血者，另一个就是建立有效的筛检手段，以检测捐献的血液中的传染性病原体。笔者就HIV检测及临床等方面作如下综述。

1 HIV流行现状及感染情况

1.1 AIDS在国际广泛流行，中国现有AIDS病毒感染者和患者约70万人，其中AIDS患者约8万人，相邻西南的边境的云南、广西尤其严重[1]。母婴传播HIV日益受到关注，未进行干预的孕期和分娩期发生传染可能性分别为10%和15%[2]。献血员人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）筛查尤为重要。用酶联免疫吸附方法（ELISA）对献血者的血液实施抗-HIV的血液筛查有利于保障血液安全[3]。其中注射吸毒人群是传播AIDS的重要人群，HIV阳性检出率为4.46%，低于四川省2003年哨点监测的检出率10.42%，高于深圳南山区卫生防疫站4.08%[4]。近年来检出率不断提高，假阳性降低，2003至2004年转诊到广西CDC无国界医生组织（法国部）免费ART的18例，按原广西标准CD+4低于350个/mm3才治疗，则88.89%（16/18）的患者需医治[5]，以上资料表明HIV流行情况不容乐观，加强落实预防措施，降低HIV感染率是医务工作者及政府共同的责任。

1.2 HIV合并感染HIV感染除了能导致艾滋病，还可以引起一系列不同的严重后果，对于的患者主要病变是继发性感染疾病，也就是由于对在正常情况下存在并可控制的病原体的失控所造成的，包括：卡氏肺囊虫引起的脑炎，结核分枝杆菌或胞内分枝杆菌引起的结核，慢性隐孢子4病，弓形虫病，病毒性感染（如巨细胞病毒）等。其中AIDS患者机体免疫功能的低下合并其他感染很高，国内调查发现HIV合并感染人群可高达70%～90%[6]。单纯疱疹病毒（HSVⅡ）是合并感染疾病中常见病原体之一；合并感染高达35.71%[7]。HIV与HBV等病毒合并感染，超过80%的HIV阳性者感染过HBV，在HIV患者中HBV标志物的阳性率明显高于HBsAg阳性率，这种双重感染患者主要集中在撒哈拉以南的非洲和亚洲东南部。在西方国家，HIV/AIDS感染者HBV总感染率为6%到10%，是普通人群的10倍，在欧洲，HIV感染者中HBsAg阳性率约占9%。毒性肝炎所导致的严重肝脏疾病已经成为HIV/AIDS患者重要死亡原因，HIV/HBV双重感染者因严重肝脏疾病死亡的比例显著高于普通人群[8]。调查发现[9]：3560例静脉吸毒者共检出抗HIV阳性72例，感染率为2.02%。HBV、HCV感染率分别为34.8%和58.1%，均高于非静脉吸毒者。其中有共用注射器史者HIV、HBV、HCV感染率高于无共用注射器史者。71例HIV/HCV重叠感染者中ALT增高48例，16例HBV/HIV重叠感染者中ALT增高2例，ALT异常率分别为67.6%和12.5%。对604人同时进行了弓形虫抗体和CD4+T淋巴细胞水平检测，HIV阳性人群弓形虫抗体阳性率为1.32%[10]。调查发现：呼吸内科以肺部结核、霉菌或支原体感染并HW感染多见；霉菌、支原体、衣原体等条件致菌在消化道或皮肤等器官感染繁殖也比较常见。由于本次调查医院中有传染病医院，各类传染性疾患者比较集中，因此抗-HIV在呼吸内科、皮肤科部门检测阳性率相对较高。同时提示：对呼吸道、化道分泌物检出条件致病菌者以及皮肤反复带状疱疹患者进行抗-HIV检测有重要意义[11]。

2 HIV检测方法

2.1 对于HIV感染，虽然有一个阶段仅能检测病毒抗原，但这一阶段很短，可能只有几天时间，所以检测病毒抗原通常不是一个合适的方法。HIV抗体检测是确定感染的献血者的首选方法，该病毒还出现在血液的白细胞中，而抗体没有保护机体免受再次感染的作用，所以抗体存在即意味着献血者携带有病毒，因此，HIV抗体检测是诊断AIDS和HIV感染的有效途径。ELISA灵敏度高、特异性强、操作简便、试剂稳定等优点，是HIV抗体筛查常用方法之一[11]。其原理是用已知抗体包被固相载体，加入待测血清，若血清中含有p24抗原则与抗体结合形成复合物，再加入酶标记抗体与抗原结合，加底物显色，然后测定吸光度值读取结果HIV抗体ELISA检测技术[12]，使用HIV-1与HIV-2混合型试剂的ELISA法仍是最常用的HIV抗体筛查试验，根据包被物不同及其他试剂、标本加入先后差异，可分为间接法、竞争法、夹心法和捕捉法。ELISA法检测血清gp24及gp120抗体，其阳性率可达99%，检测尿液、唾液或脑脊液亦可获阳性结果[13]。明胶颗粒凝集试验（gelationparticleagglutinationassay，PA）通过包被了HIV抗原的颗粒凝聚来检测HIV抗体。PA是一种快速、简便的筛查试验，很适合对少量标本的检测，灵敏度不及ELISA。金标快速反应试验将颗粒凝聚和酶免疫测定（EIA）技术相结合，用于快速检测抗-HIV。无创性HIV抗体检测[13]除血浆或血清外，人体的其他体液（如唾液、尿液和阴道洗液等）也可检测到HIV抗体。唾液HIV抗体检测在硝酸纤维膜上包被基因工程合成的gp41等蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV1/2抗体、尿液HIV抗体。HIV抗体检测的试剂根据试剂盒中抗原的来源进行分代，第一代使用的是纯化的或非经纯化的天然病毒或是被病毒感染的细胞溶解产物。第二代方剂盒使用的是重组抗原，通过将病毒酸片整合到酵母菌内，经基因工程使酵母菌大量扩增，再纯化病毒蛋白等步骤获得。第三代试剂樖国使用通过化学合成法人工合成的病毒多肽。目前已经发展到第4代，试剂灵敏度明显比前几代高，检测窗口期也明显缩短。而国内外主要使用第三代试剂在感染早期抗体检测，可检测病毒相关抗原即p24抗原，可在个体感染后2-18d被检测到。通过检测p24抗原可作为早期辅助检测HIV感染的一种方法。p24抗原检测方法主要有酶联免疫分析（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫荧光分析技术（IFA）、免疫吸附电镜法（ISEM）等技术，其中以采用ELISA方法测定p24抗原是检测HIV感染的常规方法。由于HIV感染早期p24抗原量很少且病程发展过程中抗原抗体形成复合物影响检出率。免疫印迹试验（westernblot，WB）被称为抗-HIV检测的“金标准”，它的原理是将HIV病毒蛋白通过十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的蛋白带分离开来，再把这些已经分离的不同蛋白转移到醋酸纤维素膜上，再将此膜切割成条状，每一条醋酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原[9]。

2.2 HIV核酸检测可分为定性检测和定量检测。HIV核酸定性检测的方法有原位杂交、RNA印迹、DNA印迹、反转录PCR技术等，反转录PCR最为常用，敏感度很高，但也存在因污染等原因造成的假阳性；HIV核酸定量检测即病毒载量测定，一般以每毫升血浆中检出的HIVRNA拷贝数来表示。病毒载量测定主要用于评估HIV感染的进程、确定抗病毒治疗方案、监测抗病毒治疗效果以及HIV感染早期的辅助诊断[13]。HIV病毒载量检测主要有[14]：PCR检测法（聚合酶链反应） PCR技术基于对RNA逆转录酶的作用，使病毒RNA逆转录为CDNA，随后进行多聚酶链反应，扩增DNA片段，使其达到可检测的含量。分支DNA信号扩增检测法（bDNA） 该方法是通过将捕捉到的病毒基因信号扩增直接检测RNA，即从HIV中提取分离RNA，与靶探针杂交抽取RNA，再通过另一部分靶探针使支链DNA分子与RNA结合，利用化学发光原理进行扩增信号，发光强度与HIV-RNA含量呈比例关系。核酸序列扩增试验（NASBA） NASBA又称自主序列复制系列（3SR）或再生长序列复制技术，是以RT-PCR为基础核酸检测方法。

2.3 分子生物学检测技术[15]不断应用于HIV的检测中，已成为HIV实验室诊断发展方向，可在血清学变化之前检测到HIV感染，且比P24抗原检测方法更灵敏。主要方法：原位杂交（insitehyrization）：指应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，最初为放射性标记，逐渐发展为酶标记或化学发光试剂标记。另外实时荧光定量PCR技术、连接酶酶促链式反应（LCR）、基因芯片检测技术、逆转录PCR技术（RT-PCR）等主要用于科技研究，多种改良的快速RT-PCR检测方法可实现HIV的快速临床诊断[16]。纳米粒子生物条形码检测技术（nanoparticle-basedbiobarcodeamplificationassay，BCA）新方法。根据免疫学原理，应用特异性抗-P24单克隆抗体，特异性结合样本中的P24蛋白抗原，通过生物条形码DNA准确而特异地放大，间接定量检测HIV-1P24抗原[17]。王国蓉报道[18]免疫层析/渗滤实验（胶体金/硒免疫层析法）是近年迅速发展起来的简便、快速、准确的一种检测方法。整个操作及判定结果仅需3～15min，特异性好，敏感度也较高，对应急使用及无偿献血等较为实用。

3 HIV检测效果分析与展望

目前的血液病毒筛查方法都存在或多或少的窗口期，窗口期漏检所带来的输血后病毒感染残余关系到患者的健康。窗口期包含两个方面的意义：一是此期机体自身是否真正针对HIV产生特异性的体液免疫而产生HIV抗体；二是如果有抗体产生，所使用的抗体检测试剂敏感度不够，仍检测不出抗体，也被归为窗口期。由于窗口期等因素的影响，我国经筛查后的合格血液在理论上仍存在着传播HIV的风险。第4代试剂基于第3代基础上增加了p24抗原的检测，提高试剂敏感性将检测的窗口期缩短到4～14d，减少急性感染者窗口期的漏检，但其特异性却低于第3代，还需进一步提高特异性[19]。劳丽嫦认为[20]一步法和二步法的敏感性均达到100%，但存在不同程度的假阳性，一步法和二步法的假阳性率分别是0.17%和0.05%，一步法假阳性率明显高于二步法（P＜0.01）。理论和实践都说明双抗原夹心双位点一步法检测HIV抗体确实存在因浓度过高而出现假阴性的漏检问题。检测效果还与各种因素相关，比如溶血样品虽然对双抗原夹心法检测

HIV抗体结果影响较小，但是如果试剂反应孔包被、封闭的质量差可能引起Hb的非特异吸附而造成假阳性[21]，因此日常工作中遇到溶血标本应重新采取合格样本检测，选择经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂[22]。在实际工作中，ELISA检测HIV抗体会受多种影响，导致检测结果出现偏差。因此，为保证检测结果的准确性，通常在检测中会设立一个弱阳性质控血清来监测检测的重复性、稳定性及弱阳性标本的检出。ELISA的分析方法，灵敏度终归是有限的，相对化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等更为先进的分析方法，其灵敏度仍较低[23]。国内部分血站已经开始尝试用核酸筛查法以进一步降低输血风险，并取得了成果。Kim等[24]应用BCA检测112份HIV-1感染血浆样本中的p24抗原，发现BCA可检测各个亚型HIV-1的p24抗原，特异性100%，敏感性99%，远远高于普通ELISA法检测p24抗原的敏感性（34/112）。Tang等[20]应用改进的BCA进行研究发现（用抗-p24包被微孔板捕获样本中的P24抗原，用链亲和素包被的纳米粒子生物条形码DNA扩增信号，然后用芯片扫描进行检测），这种方法较普通

ELISA敏感150倍，45例HIV-1RNA阳性血浆的BCA检出率为100%，且可比普通ELISA法提前3d检出p24抗原。BCA法不失为一种早期检出

p24的较为敏感的方法[25]。病毒分离培养常用外周血淋巴细胞（PBL）进行病毒培养，能提供HIV病毒感染早期及临床AIDS期的诊断依据。我国现在正处于HIV感染力的快速增长期，流行形势十分严峻，检测方法的选择是切断输血感染HIV的最重要环节，我们要采取切实可行的办法以阻断经血传播HIV。

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