畜牧兽医科技文摘

健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺线粒体蛋白组差异表达分析/王建锋（甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070），陶金忠，张 勇…//中国兽医学报.-2012，32(1).-63～68

运用亚细胞蛋白质组学的研究策略，分离纯化亚细胞结构再进行蛋白质组学研究，可提高低丰度蛋白在双向凝胶电泳中的检出率。通过对比分析乳腺炎奶牛乳腺与正常奶牛乳腺线粒体蛋白质组的表达变化，为奶牛乳腺炎的生物学治疗及抗病育种工作筛选出目基因和蛋白。超速离心法分离线粒体，双向凝胶电泳分离蛋白，PDQuest7．4软件分析差异蛋白斑点，高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定差异蛋白。从奶牛乳腺线粒体蛋白2－DE图谱中筛选出17个差异表达的蛋白质斑点，质谱鉴定出17个差异表达蛋白（6个蛋白在奶牛乳腺炎发生过程中下调，8个上调，1个只在正常情况下表达，2个只在乳腺炎乳腺组织中表达）。筛选出的差异蛋白质涉及到细胞的能量代谢、蛋白质合成、mRNA的加工成熟及调亡调控等许多方面，表明奶牛乳腺炎发生时乳腺线粒体组织结构和代谢状态都发生了明显的变化。

一种直接用于PCR 扩增的山羊瘤胃微生物DNA 提取方法的建立/许发芝（安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036），吴胜国，李吕木…//中国微生态杂志.-2012，24(1).-66～68

目的建立提取高质量的瘤胃微生物DNA 的方法，为采用免培养技术研究山羊瘤胃微生物奠定基础。方法：采集山羊瘤胃内容物，用SDS 高盐法提取微生物总DNA，以通用引物扩增细菌和古细菌的16S rDNA。结果提取到的瘤胃微生物总DNA 片段大于23 kb，PCR 能够扩增出细菌和古细菌的16S rDNA 片段。结论用该提取方法得到的山羊瘤胃微生物总DNA 能够满足后续实验的需要。

鸭毛囊中ASIP基因片段的克隆及组织表达分析/梁正翠（扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009），杨海明，王志跃…//中国兽医学报.-2011,31(6).-864～869

根据GenBank发表的鸡刺鼠信号蛋白(ASIP)基因序列的同源保守区域,设计了1对特异性引物。以番鸭、高邮鸭和英系北京鸭(即樱桃谷鸭)毛囊RNA为模板,经扩增、测序及拼接得到的部分mRNA序列均为编码序列,共308bp,对应编码102个氨基酸。与已发表的原鸡和鹌鹑的ASIP对应的mRNA核苷酸序列进行比对,番鸭、高邮鸭和英系北京鸭的同源性均在92.53%以上,相应编码的氨基酸序列同源性均高于92.16%。高邮鸭与英系北京鸭核苷酸,氨基酸序列一致,同源性为100%。半定量PCR结果显示,番鸭ASIP基因表达具有较高的普遍性,在皮肤组织(毛囊和皮肤)和中枢神经系统(下丘脑)及其他非皮肤中均有表达。皮肤和毛囊的表达差异不显著(P＞0.05),下丘脑中的ASIP基因相对表达量最高,极显著高于皮肤中ASIP基因的表达量(P＜0.01),而与毛囊中的差异不显著(P＞0.05)。

奶山羊BLG基因敲除载体的构建/陈华涛（西北农林科技大学动物医学院农业部动物生殖生理和胚胎工程重点开放实验室，陕西 杨凌 712100），李倩，胡林勇…//中国兽医学报.-2011，31(6).-858～863

根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。

猪源链球菌对大环内酯类主要耐药基因的检测/芮萍（河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066004），马增军，陈翠珍…//中国兽医学报.-2011，31(6).-838～842

为了解猪源链球菌对红霉素相关耐药基因ermB、ermA和mefA的分布,对河北省及辽宁部分地区的64株猪源链球菌分离株,用PCR方法检测51株红霉素耐药株和13株红霉素敏感株中ermB、ermA和mefA基因。结果显示,耐药菌株中ermB基因的检出率为98.04%(50/51),ermA的检出率为25.49%(13/51),没有检出mefA基因。初步表明河北省及辽宁部分地区的猪源链球菌对红霉素的耐药机制以ermB基因介导为主。20株菌的ermB基因核苷酸序列与GenBank中同源序列相似性为99%～100%。与参照序列AJ972604.1相比,20株菌的ermB氨基酸序列的突变位点较少,主要有Thr 75→Ser、Ser 100→Asn、Arg 118→His、Leu 175→Ile,以100和118位突变为主,进一步说明ermB基因是相对稳定的。

利用反向遗传技术拯救H9N2重组病毒/井波（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001），李呈军，陈化兰//中国兽医学报.-2011，31(6).-835～837，851

为研制高效特异的H9N2亚型AI疫苗,选取我国具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(简称SH10),以12质粒系统为基础,利用反向遗传操作技术构建了1株表面基因由SH10提供、内部基因由12质粒系统提供的重组病毒SH/PR8,为新型疫苗的研制提供了新的毒株。

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞skp2表达的影响/甘瑞（西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室 重庆 400716），左敬，张国升…//畜牧兽医学报.-2011，42(6).-765～771

本研究旨在确定促卵泡素是否可通过cAMP、Ca2+内流和细胞外调节的蛋白激酶(ERK1/2)调节培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中S期激酶相关蛋白2(skp2)的表达。以培养的仔猪睾丸支持细胞为实验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,运用Western blot检测skp2、p27kip1蛋白的表达,运用实时荧光定量PCR检测skp2mRNA的表达。结果发现,促卵泡素(50ng.mL-1)以时间依赖的方式促进了skp2蛋白和mRNA的表达(P＜0.05),这一作用在30min时达到高峰。FSH(50ng.mL-1)和Forskolin(10μmol.L-1)均促进了skp2蛋白和mRNA的表达(P＜0.05),但降低了p27kip1蛋白的水平,而Rp-cAMP、Verapamil和U0126都抑制了FSH的作用,使skp2蛋白和mRNA的表达有所下降,但提高了p27kip1蛋白的表达,但3种抑制剂单独作用时对skp2蛋白、mR-NA以及p27kip1蛋白的表达没有显著影响(P＞0.05)。这表明FSH可能主要通过影响cAMP的产生和Ca2+内流,并激活ERK1/2通路调节skp2蛋白的表达,而skp2蛋白的水平与p27kip1蛋白成负相关。

猪SelS基因启动子区的克隆及序列分析/张宁波（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 100193），井文倩，李奎//畜牧兽医学报.-2011，42(6).-759～764

本研究旨在克隆和分析猪硒蛋白S基因(Selenoprotein S,SelS)启动子序列,并初步探讨潜在转录因子结合位点对其表达的影响。通过SON-PCR技术克隆猪SelS基因启动子序列,利用PromoterScan、Promoter 2.0等在线工具预测其启动子特征,利用细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激PK15细胞,研究NF-kappaB转录因子对猪SelS基因启动子活性的影响。试验获得了猪SelS基因约3kb的启动子序列,部分序列比对发现猪、人、牛和小鼠物种间相似性仅7%～51%。预测猪SelS基因转录起始位点在-398bp,猪和人SelS基因启动子存在系列保守的转录因子结合位点,包括NF-kappaB、CCAAT box、SP1、USF等,但均未发现典型的TATA box。细胞试验表明,NF-kappaB转录因子可以上调猪SelS基因的表达。结果提示,物种间SelS基因启动子相似性较低,但猪和人SelS基因的转录因子非常保守,LPS诱导试验提示,猪SelS基因表达可能受NF-kappaB转录因子的调控。

鸡恒定链分子跨膜区2个氨基酸残基在形成MHCⅡ-Ii复合物中的作用/许发芝（安徽农业大学安徽省人兽共患病学重点实验室，合肥23003），吴胜国，刘雪兰…//畜牧兽医学报.-2011，42(5).-721～728

本研究旨在探明鸡恒定链跨膜区特定氨基酸在形成MHCⅡ-Ii复合物聚合中的作用特征。用大引物PCR定点突变法将鸡Ii链跨膜区2个氨基酸Gln47和Thr50分别突变为丙氨酸(Ala),再连接到pEGFP-C1载体中,构建含Ii-GFP融合基因的真核表达载体。同时还分别构建了含pDsRed2-N1-MHCⅡα、pDsRed2-N1-MHCⅡβ、pEGFP-N1-MHCⅡα和pEGFP-N1-MHCⅡβ真核表达载体。用脂质体介导法将这些重组质粒单独或共转染至COS-7细胞,培养48h后经荧光显微镜检测野生型Ii和突变型Ii与MHCⅡ类分子的细胞定位,并通过免疫共沉淀研究它们之间的相互关系。结果显示,野生型Ii链与MHCⅡα或MHCⅡβ之间存在细胞内的共定位,而突变型Ii与MHCⅡα或MHCⅡβ在细胞中共表达后未出现共定位现象。免疫共沉淀结果显示,在野生型Ii链与MHCⅡα或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均能检测到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物,而突变型Ii链与MHCⅡα或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均检测不到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物。因此Ii链跨膜区Gln47和Thr50 2个氨基酸对于MHCⅡ-Ii复合体的形成是至关重要的。

3种受体抑制剂对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响/尹鑫（东北农业大学动物医学学院 哈尔滨 150030），张颖，刘澜澜…//畜牧兽医学报.-2011，42(5).-704～710

本研究旨在阐明鸡氨肽酶N(chAPN)、唾液酸以及硫酸乙酰肝素在传染性支气管炎病毒(IBV)M41株感染宿主细胞中的作用以及3种受体特异抑制剂对IBV M41株在自然宿主CEK细胞内增殖能力的影响。作者选择苯丁抑制素(Bestatin)、神经氨酸酶(NA)和肝素酶Ⅲ分别作为APN、唾液酸以及硫酸乙酰肝素的抑制剂,在不同条件下,单独或共同预处理CEK细胞,而后接入IBV M41株病毒感染细胞,应用荧光定量PCR方法定量检测IBVM41株在CEK细胞中的增殖变化,应用鸡胚半数感染剂量法(EID50)测定病毒感染鸡胚能力的变化。结果表明,经Bestatin和NA处理的CEK细胞获得了抵抗IBV M41株感染的能力,与未经处理的(对照组)细胞相比,Besta-tin和NA能显著降低IBV M41株在CEK细胞内的增殖及对鸡胚的感染能力(P＜0.01),且Bestatin处理后CEK细胞内的病毒增殖量显著低于NA处理后CEK细胞内的病毒增殖量,两者病毒液的EID50滴定值差异显著(P＜0.01);肝素酶Ⅲ的处理则对病毒增殖无显著影响;3种受体抑制剂共同处理CEK细胞后,病毒增殖量显著下降(P＜0.01),但仍有病毒增殖,病毒液的EID50滴定值为102.12±0.05.0.1mL-1。结果提示,chAPN在IBV感染宿主细胞的过程中发挥特异性受体作用,而唾液酸在IBV感染宿主细胞中发挥辅助受体作用,硫酸乙酰肝素不是IBV在自然感染中的必需因素,同时提示,可能存在其他未知受体因子参与IBV感染宿主细胞的过程。

不同采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响/卿玉波（云南农业大学 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201），魏红江，姜河海…//畜牧兽医学报.-2011，42(5).-629～634

本研究旨在开发出一种对COCs损伤小且采集效率和卵母细胞成熟率高的卵母细胞采集方法。从屠宰场采集来的卵巢运回实验室后随机分为3组,分别用抽吸法、解剖法和刀切过滤法3种方法采集COCs,然后进行体外成熟培养,通过对COCs采集效率、COCs完整性及卵母细胞体外成熟率的比较,研究解剖法、刀切过滤法和抽吸法3种采集方法对猪卵母细胞的采集效率和成熟率的影响。结果表明：每个卵巢采集COCs个数,刀切过滤法显著高于解剖法和抽吸法(P＜0.05),而解剖法仅为1.55个,显著低于抽吸法(P＜0.05);采集效率抽吸法最佳,采集和挑选单个COCs的时间显著低于解剖法和刀切过滤法(P＜0.05),刀切过滤法次之,但显著低于解剖法(P＜0.05);A、B级COCs比例,解剖法高达99.23%,显著高于其他2种方法(P＜0.05),刀切过滤法与抽吸法差异不显著(P＞0.05);卵母细胞的成熟率,解剖法和刀切过滤法都达到80%,二者间差异不显著(P＞0.05),但显著高于抽吸法(P＜0.05);100个成熟卵母细胞所需的卵巢数量,刀切过滤法最少,仅为17.4个,而解剖法和抽吸法分别高达80.6和90.3个;需要的总采集时间(采集和挑选的时间),刀切过滤法最低,仅为126.6min,而解剖法最高,为758.9min。综上所述,与抽吸法和解剖法相比,刀切过滤法是一种高效、快速的卵母细胞采集方法。