结直肠癌外周血中预后相关因子的研究进展

杨莉 李聪 综述 徐烨 审校

复旦大学附属肿瘤医院大肠外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万新发病例，大量患者死于术后复发和转移。尽早预测患者复发和转移的风险，选择合理的个体化治疗方案，动态监测疾病进展过程，这些对于改善CRC患者的预后极其重要。

目前应用于临床的方法都不令人满意。如何能较早准确评估患者复发和转移的风险，将同一分期但复发转移风险不同的病人进行区分，从而及时选择合理的治疗方案是目前亟待解决的问题。

外周血中储存了大量的核酸和炎症免疫等预后相关的信息，并且 不受标本收集、无法连续检测和随访等诸多因素的肿瘤组织学限制，具有潜在的研究及临床应用价值。现将CRC外周血预后相关因子的研究对象、主要方法、已有成果和存在问题作一综述。

1 外周血循环肿瘤细胞

目前将循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)定义为起源于原位肿瘤或者转移灶的肿瘤细胞，在明显的转移出现之前，局部的肿瘤可能发动CTC进入外周循环，CTC本身具有或者获得了逃避机体免疫系统并且到达远处器官的作用，与多种肿瘤的不良预后相关［1-2］。Rahbari等［3］评估了CRC患者外周血中CTC和预后的相关性，结果证实CTC是潜在的CRC预后标志物。

CTC的检测方法主要有密度梯度离心、免疫磁珠选择、聚合酶链反应以及流式细胞仪技术等，这些技术显著推动了外周血中数量稀少的CTC的研究。

为了提高检测的敏感性和特异性, 近年来的文献中多使用富集与检测技术相结合的自动化检测系统，使用最多的是Cell Search检测系统。Cell Search系统是目前唯一通过美国FDA批准用于临床的CTC检测技术，该技术被认为是CTC计数的金标准［4］。

但是CellSearch检测系统存在以下问题：

⑴CK19、CK20 mRNA等常用的CTC检测标志物其实是上皮细胞标志物，所测得的CTC结果实际是循环上皮细胞(circulating epithelial cells，CepC)。

⑵CTC脱离母体后，可能经历自我变异，所表达的上皮成分会减少甚至丢失。例如，EpCAM被认为是CRC组织的特征抗原，用EpCAM包被的抗体来富集CTC的方法是免疫分离技术常用的方法，目前认为，EpCAM在肿瘤侵袭过程发生的上皮间质转化中表达下降，导致CTC的基因表型与原发灶不一致［5］。若用传统的标志物检测CTC，可能漏掉侵袭转移力最高的CTC。

此外，针对CTC基因组的分析，Barbazan等［6］指出TIMP1、VCL、ITGB5、BMP6、TGFb1和CLU等CTC特异基因的表达与CRC的诊断及预后相关。这些特征基因涉及了肿瘤细胞侵袭表型的获得、粘附和迁移等多个方面。其中，CTC中TIMP1的表达和CRC肝脏转移相关，是肝脏微环境的调节因子，增加了器官对于肿瘤细胞的易感性［6-7］。

目前，大多数的研究都是围绕着CTC的特异基因展开，目的是寻找到高度特异的CTC标志物。今后，在建立标准的CTC检测方法的基础上，针对CTC分子特征进行研究，确定其生物学行为及作用机制，从而为针对CTC的肿瘤靶向治疗提供依据，将是肿瘤研究的一个新领域。

2 外周血循环核酸

在多种肿瘤患者的外周血循环核酸中存在肿瘤特异的或与肿瘤相关的改变。血浆和血清中的循环核酸的产生不仅是通过细胞裂解，也可以通过细胞的活性分泌［8］。

大量研究显示，外周血中游离的DNA量在肿瘤良恶性、分期、治疗后变化和患者生存期等方面都有意义。通过检测外周血游离核酸水平有助于初步筛查CRC患者、判断肿瘤侵袭转移以及评估疗效和预后。

在CRC及其微转移的早期，外周血中CEA mRNA比CEA 蛋白更早地出现升高，且CEA mRNA水平变化与CRC的分期、进展和转移相关，定量检测外周血CEA mRNA水平可作为CRC辅助诊断和监测微转移的有效指标［9-10］。这提示外周血中CEA mRNA水平可能与CRC患者预后相关。

细胞来源的miRNAs在外周血中稳定的存在，免于被内源性的RNase活性所降解。由于具有潜在的应用价值，它们的出现引起了研究者的注意。Ng等［11］报道了循环miRNAs可能是潜在、非侵入性的CRC的分子标志物。Pu等［12］直接用血浆进行miRNAs扩增，指出miR-221是潜在的CRC诊断和预后判断的分子标志物。

目前PCR技术广泛应用于CRC外周血肿瘤相关基因片段的定量检测和比较，其中RT-PCR成为最常用的一种检测技术。除此之外，有研究显示，与PCR相比，BEAMing(Beads Emulsion Amplification Magnetics)的流式磁珠检测技术能在血浆中检测出更微量的基因片段［13］。

循环核酸作为潜在的预后标志物存在以下问题：

⑴尚未有成熟的技术用于外周血循环核酸的研究及临床检测。

⑵虽然血清和血浆中都能检测到肿瘤相关核酸, 但两者的结果并不相同。

3 外周血炎症反应

肿瘤的侵袭和转移力取决于肿瘤细胞自身以及机体环境两个方面。肿瘤的异常表型可以刺激炎症淋巴细胞在肿瘤组织周围浸润。此外，由肿瘤的生理作用导致的组织破坏和降解可能引起普遍的非特异性的炎症反应。炎症反应促进肿瘤细胞分化和存活、引起氧化应激、促进血管生成，在肿瘤生长、扩散及预后方面起着重要作用［14］。

系统炎症反应( systemic inflammatory response)是由肿瘤细胞和免疫细胞产生的包括IL-1β、IL-6和TNF-α在内的前体炎症细胞因子驱动的，同时伴随局部的免疫反应，在多种常见实体肿瘤进展中起重要作用，并且在术前易评估，具有潜在的研究及应用价值［15］。

3.1 炎症相关因子

3.1.1 C-反应蛋白( C-reactive protein，CRP)

前体炎症细胞因子刺激急性期蛋白的释放，最明显的是CRP。血浆中升高的CRP与实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的不良预后相关，并且可能是CRC预后的独立因素［16］。有研究指出CRP可以结合到激活的Fc受体，激活PI3K/Akt、ERK和NF-kappaB通路，抑制由化疗药物引起的细胞凋亡蛋白酶的激活等，在恶性肿瘤的进展中起直接作用［17］。

3.1.2 血清白蛋白

血清白蛋白也是反映系统炎症的急性期蛋白。目前认为系统炎症与血清白蛋白浓度的降低相关，血清白蛋白浓度的降低促进了循环前体炎症细胞因子水平的升高，尤其是IL-6。低白蛋白血症与晚期恶性肿瘤患者不良预后相关。Neal等［18］的研究显示，血清白蛋白是肠癌肝转移(colorectal liver metastases)术后不良预后的一个独立的风险因子。

3.1.3 系统炎症评分

基于血清CRP和白蛋白水平的改良格拉斯哥预后评分( modifi ed glasgow prognostic score，mGPS)是重要的评价机体系统炎症的指标。有研究显示，在术前CEA水平正常的CRC患者中，mGPS可以辅助预测患者的术后生存［19］。Furukawa等［20］指出mGPS是预测伴有不可切除肝转移的CRC总体生存的独立因素，当白蛋白＜3.5 g/dL、CRP＞1.0 mg/dL时，患者预后不良。Proctor等［21］的研究结果肯定了mGPS在恶性肿瘤预后中的作用，并且建议mGPS可应用于临床实践，但同时指出其预后作用与肿瘤部位无关。

3.2 细胞成分

3.2.1 中性粒细胞

在多种恶性肿瘤中，循环中性粒细胞计数具有预后价值。

骨髓来源的细胞，尤其是中性粒细胞，通过提供合适的生长环境，促进肿瘤的发生、发展，在促进肿瘤侵袭表型中起了直接的作用。中性粒细胞是TGF-β等可能诱导肿瘤细胞增殖和侵袭配体的主要产生者。再者，中性粒细胞释放的循环血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)具有促进肿瘤血管形成及肿瘤细胞的侵袭能力，从而在肿瘤的发展过程中起重要作用。

3.2.2 中性粒细胞与淋巴细胞计数的比值(neutrophil -to-lymphocyte ratio，NLR)

系统的炎症反应也反映在外周循环白细胞相对水平的改变上。Walsh等［22］发现了NLR在CRC患者中的预后价值，分析了Dukes’A到Dukes’D期的CRC病例，得出术前NLR＞5的患者预后较差，并且NLR的平均比值伴随疾病的分期增加而增大。最新的一篇文献指出，NLR＞5可以预测CRC伴肝转移患者在接受经皮射频消融治疗后的不良预后［23］。

尽管目前有很多研究支持炎症相关因素与CRC患者预后相关的观点，但是其具体作用机制的研究仍在进行。

Richards等［24］指出肿瘤坏死是启动全身炎症反应的因素，其作用机制可以解释为恶性肿瘤细胞对氧化应激反应的结果。炎症和坏死共同为基因突变、表观调控、细胞死亡和增殖提供环境。在慢性炎症的部位，细胞坏死促进局部上皮细胞的生长和增殖，并且通过内源性的抑制因子阻断与凋亡相关的重要通路，从而限制细胞凋亡的启动。同时，释放的坏死介质进一步激活炎症通路，这些炎症通路在肿瘤血管的形成、上皮细胞的增生和基质的形成等方面十分重要，是肿瘤生长所必须的条件［25-26］。

系统炎症在多个方面影响肿瘤的发生、发展，由于其涉及范围广、机制复杂，目前对系统炎症方面的研究大部分集中于临床数据的统计和分析，今后需要研究者对炎症机制进行更加深入的研究，从而确定系统炎症影响肿瘤发生、发展的各个环节。

4 凝血相关指标

恶性肿瘤患者的血液多呈高凝状态，血浆纤维蛋白原水平、血小板水平等相比一般疾病显著升高。

有研究显示，CRC患者治疗前的血小板水平与肿瘤相关的生存率有关，治疗前血小板水平升高是CRC患者复发、转移等不良预后的独立预测因子［27］。肿瘤细胞与血小板的相互作用机制可以解释为以下几点：

⑴肿瘤细胞通过分泌IL-6等相关因子，刺激骨髓产生巨核细胞，从而导致血小板增多。

⑵肿瘤细胞通过分泌VEGF和表达多种膜表面受体来激活血小板、促进血小板黏附于肿瘤血管的内皮细胞。

⑶激活状态的血小板产生多种微粒和血管生成因子，例如血小板来源生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)和VEGF，促进肿瘤血管形成，增加肿瘤细胞的黏附、增殖和趋化作用，从而加速肿瘤的生长、增强侵袭力［28］。

此外，凝血和纤维蛋白溶解的激活在肿瘤侵袭过程中起重要作用。D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子ⅩⅢ交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物，其水平的增高反映继发纤溶活性的增强，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。

5 总结

本文从不同的角度论述了重要的预后相关因子，但是这些预后相关因子可能并非独立作用于肿瘤的发生发展，它们在深层的作用机制上相互关联和渗透。今后需要更多的前瞻性研究来进一步证实目前所得因子的预后价值，以及深入的基础研究来确定预后相关的细胞信号通路、基因的改变和肿瘤细胞生长的标志物，从而为新的肿瘤治疗策略提供理论依据，进而改善CRC患者的生存。

［1］AGGARWAL C, MEROPOL N J, PUNT C J, et al.Relationship among circulating tumor cells, CEA and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer［J］.Ann Oncol, 2012.［Epub ahead of print］.

［2］HANAHAN D, WEINBERG R A.Hallmarks of cancer: the next generation［J］.Cell, 2011, 144(5): 646-674.

［3］RAHBARI N N, AIGNER M, THORLUND K, et al.Metaanalysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer［J］.Gastroenterology, 2010, 138(5): 1714-1726.

［4］LOWES L E, HEDLEY B D, KEENEY M, et al.User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the Cell Search(R) system［J］.Cytometry A, 2012, 81(11): 983-995.

［5］BONNOMET A, BRYSSE A, TACHSIDIS A, et al.Epithelialto-mesenchymal transitions and circulating tumor cells［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2010, 15(2): 261-273.

［6］BARBAZAN J, ALONSO-ALCONADA L, MUINELOROMAY L, et al.Molecular characterization of circulating tumor cells in human metastatic colorectal cancer［J］.PLoS One, 2012, 7(7): e40476.

［7］SCHELTER F, GRANDL M, SEUBERT B, et al.Tumor cellderived Timp-1 is necessary for maintaining metastasispromoting Met-signaling via inhibition of Adam-10［J］.Clin Exp Metastasis, 2011, 28(8): 793-802.

［8］SCHWARZENBACH H, HOON D S, PANTEL K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients［J］.Nat Rev Cancer, 2011, 11(6): 426-437.

［9］FERRONI P, ROSELLI M, SPILA A, et al.Serum sE-selectin levels and carcinoembryonic antigen mRNA-expressing cells in peripheral blood as prognostic factors in colorectal cancer patients［J］.Cancer, 2010, 116(12): 2913-2921.

［10］LIU Z P, LI L M, LIU X L, et al.Comparative analysis of tumor markers and evaluation of their predictive value in patients with colorectal cancer［J］.Onkologie, 2012, 35(3): 108-113.

［11］NG E K, CHONG W W, JIN H, et al.Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening［J］.Gut, 2009, 58(10): 1375-1381.

［12］PU X X, HUANG G L, GUO H Q, et al.Circulating miR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognostic marker of colorectal cancer and is correlated with p53 expression［J］.J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(10): 1674-1680.

［13］DIEHL F, SCHMIDT K, DURKEE K H, et al.Analysis of mutations in DNA isolated from plasma and stool of colorectal cancer patients［J］.Gastroenterology, 2008, 135(2): 489-498.

［14］MANTOVANI A, ALLAVENA P, SICA A, et al.Cancerrelated inflammation［J］.Nature, 2008, 454(7203): 436-444.

［15］ROXBURGH C S, MCMILLAN D C.Role of systemic inflammatory response in predicting survival in patients with primary operable cancer［J］.Future Oncol, 2010, 6(1): 149-163.

［16］VAN DE POLL M C, KLAVER Y L, LEMMENS V E, et al.C-reactive protein concentration is associated with prognosis in patients suffering from peritoneal carcinomatosis of colorectal origin［J］.Int J Colorectal Dis, 2011, 26(8): 1067-1073.

［17］YANG J, WEZEMAN M, ZHANG X, et al.Human C-reactive protein binds activating Fcgamma receptors and protects myeloma tumor cells from apoptosis［J］.Cancer Cell, 2007, 12(3): 252-265.

［18］NEAL C P, MANN C D, SUTTON C D, et al.Evaluation of the prognostic value of systemic inflammation and socioeconomic deprivation in patients with resectable colorectal liver metastases［J］.Eur J Cancer, 2009, 45(1): 56-64.

［19］ISHIZUKA M, NAGATA H, TAKAGI K, et al.Inflammationbased prognostic system predicts postoperative survival of colorectal cancer patients with a normal preoperative serum level of carcinoembryonic antigen［J］.Ann Surg Oncol, 2012, 19(11): 3422-3431.

［20］FURUKAWA K, SHIBA H, HARUKI K, et al.The Glasgow prognostic score is valuable for colorectal cancer with both synchronous and metachronous unresectable liver metastases［J］.Oncol Lett, 2012, 4(2): 324-328.

［21］PROCTOR M J, MORRISON D S, TALWAR D, et al.A comparison of inflammation-based prognostic scores in patients with cancer.A Glasgow Inflammation Outcome Study［J］.Eur J Cancer, 2011, 47(17): 2633-2641.

［22］WALSH S R, COOK E J, GOULDER F, et al.Neutrophillymphocyte ratio as a prognostic factor in colorectal cancer［J］.J Surg Oncol, 2005, 91(3): 181-184.

［23］ZHANG Y, PENG Z, CHEN M, et al.Elevated neutrophil to lymphocyte ratio might predict poor prognosis for colorectal liver metastasis after percutaneous radiofrequency ablation［J］.Int J Hyperthermia, 2012, 28(2): 132-140.

［24］RICHARDS C H, ROXBURGH C S, ANDERSON J H, et al.Prognostic value of tumour necrosis and host inflammatory responses in colorectal cancer［J］.Br J Surg, 2012, 99(2): 287-294.

［25］VAKKILA J, LOTZE M T.Inflammation and necrosis promote tumour growth［J］.Nat Rev Immunol, 2004, 4(8): 641-648.

［26］COLOTTA F, ALLAVENA P, SICA A, et al.Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability［J］.Carcinogenesis, 2009, 30(7): 1073-1081.

［27］SASAKI K, KAWAI K, TSUNO N H, et al.Impact of preoperative thrombocytosis on the survival of patients with primary colorectal cancer［J］.World J Surg, 2012, 36(1): 192-200.

［28］JAIN S, HARRIS J, WARE J.Platelets: linking hemostasis and cancer［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(12): 2362-2367.