microRNA基因启动子甲基化的检测及其在结直肠癌临床应用中的研究进展

张升 蔡国响 综述 蔡三军 审校

复旦大学附属肿瘤医院大肠外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，全球每年新发病例约120万例。Peyrin-biroulet等［1］报道，根据2008年卫生部流行病学统计资料，中国每年新发病例已超过17万，发病率为31.39/10万。Compton等［2］报道，结直肠癌的发病率占恶性肿瘤的10.49%，复发转移是主要的死亡原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约18～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过与靶标信使RNA(messenger RNA，mRNA)特异性碱基互补配对，引起靶标mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控［3］。研究表明，其在调节基因表达，尤其是细胞的分化、转录抑制、细胞周期调节以及凋亡方面具有重要作用，人类大约30%以上的基因受miRNA调节［4］。当前，肿瘤被认为是一种既与基因改变有关也与表基因改变有关的疾病，表观遗传学研究内容包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及miRNA在内的非编码RNA介导的基因改变［5］。本文将结合表观遗传学对miRNA在结直肠癌中的研究进展进行综述。

1 研究方法

1.1 miRNA检测方法

许多学者通过高通量组学技术，如基因芯片(microRNA array)等在结直肠癌组织以及配对正常组织中检测并比较差异表达的miRNA，挑选若干个候选miRNA作为研究对象，然后进一步扩大样本量检测表达来验证。检测方法主要包括定量PCR、Northern blot等。Michael等［6］通过比较结直肠腺癌以及正常黏膜，发现miR-143和miR-145在癌组织中表达下调，接着Volinia等［7］采用miRNA芯片对比正常组织，筛查出一批在结直肠癌中表达显著升高的miRNA，包括miR-21、miR-17-5p、miR-191、miR-29b、miR-223、miR-128b、miR-24、miR-155、miR-20a、miR-107、miR-32、miR-30c、miR-221和miR-106a等。Driskell等［8］建立了表面增强拉曼光谱法(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)，与常规的定量PCR相比，该方法有较高灵敏度和精确度，能检测含量极低的miRNA，并能有效区分不同类型miRNA。Kato［9］建立了一种新的荧光DNA探针，该方法具有高度特异性，可以不通过电泳而直接区分miRNA前体和成熟的miRNA。这些研究说明对于miRNA的检测方法在不断进步，并且还有很大的提升空间。

1.2 检测DNA甲基化状态的常用方法

DNA甲基化状态分析的方法按其原理的不同，可以分为依赖于DNA序列分析的检测技术、依赖于对5-甲基胞嘧啶敏感的限制性核酸内切酶技术、依赖于甲基化芯片和质谱检测的技术等，前两种也称为甲基化分型，主要是针对较少位点检测；后一种也称为甲基化组学，则是针对较广范围甚至全基因组的甲基化分析［10］。依赖于DNA序列分析的检测技术包括：甲基化特异性PCR(msp)、定量甲基化特异性PCR(qMSP)、焦磷酸盐测序、BSP、高分辨率溶解曲线法(HRM)等［11-13］。各种方法原理不同，灵敏度和特异度也有所差异，所需要的检测成本也不同。甲基化特异性PCR主要是用于甲基化定性研究，灵敏度高但特异性差，现在应用逐渐减少，其余均为甲基化定量的研究。研究中主要是根据所检测基因甲基化位点的多少以及对甲基化数据的精确度要求，从实际情况出发挑选合适的方法。

2 甲基化调节miRNA表达

DNA的甲基化是表观遗传学的重要内容，miRNA以及DNA甲基化都与肿瘤的形成有密切的联系［14］。在哺乳动物中，DNA的甲基化发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上，CpG按一定的含量成簇地出现形成CpG岛，人类基因组中大约包括38 000个CpG岛，70%已知基因的5'端调节区有CpG岛存在［15］。而人类miRNA编码基因中约有47%与CpG岛相关［16］。在结直肠癌领域里，关于甲基化调节miRNA表达的研究越来越多，已经发现了大量与结直肠癌相关的miRNA存在甲基化调节机制［17-19］，其机理是miRNA基因启动子高甲基化导致其表达下调，影响靶基因调节，进而影响癌症通路的发生。Bandres等［20］研究发现，miR-9-1、miR129-2、miR-137基因在肠癌组织中甲基化比率显著高于癌旁正常组织，在癌组织中分别是56%(20/36)、91%(31/34)、100%(31/31)；在正常组织中分别为0、12%(4/34)、23%(7/31)。其中miR-9的表达与其基因甲基化程度呈负相关。Balaguer等［21］采用去甲基化试剂5-Aza-CdR处理HCT116、LOVO等肠癌细胞株，比较干预前后miR-137基因启动子甲基化水平以及表达水平，发现去甲基化可以使miR-137表达激活。这些研究都为进一步探讨miRNA在肿瘤发生发展中所扮演的角色提供了理论依据。

3 miRNA及其基因启动子甲基化状态在结直肠癌预后判断中的价值

3.1 早期诊断

Lu等［22］通过比较癌与正常组织中的一些miRNA表达谱，发现在鉴别分化较差的肿瘤中，检测miRNA比mRNA具有更高的准确性。另外，miRNA比mRNA更稳定，能通过血清以及粪便等体液检测出来，故检测方法的可行性高［23-24］。Cheng等［25］检测102例结直肠癌患者血清中的miR-141水平，发现其水平升高提示不良预后，联合CEA检测能提高结直肠癌复发转移诊断的准确性。Kalimutho等［26］通过筛查并检测结直肠癌患者粪便中特异性miRNA基因启动子甲基化状态，发现miR34-b/c以及miR-148a基因启动子过度甲基化分别可以作为结直肠癌早期筛查以及随访的生物学标志。在结直肠癌中，miR137基因甲基化是一个早期事件，其在癌组织中的甲基化程度明显高于正常组织，因此可以作为结直肠癌早期筛查的一个分子标记物［21］。Ng等［27］通过检测并比较结直肠癌患者与健康人群外周血中的miR-92a表达差异，发现在结直肠癌患者血清中miR-92a表达水平显著升高，提示检测外周血miR-92a水平可以作为一种筛查结直肠癌的无创性方法。这些研究表明，miRNA及其基因启动子甲基化的检测在临床诊断中具有潜在的应用空间，在组织中发现特异性的miRNA表达或其基因启动子甲基化差异，通过外周血或者代谢物检测，从而实现其筛查以及早期诊断某些相关疾病的临床价值。

3.2 判断预后

通过检测某些与结直肠癌相关的miRNA表达水平或者其基因甲基化水平可以判断预后。Bandres等［20］在结直肠癌细胞株中通过去甲基化干预，发现miR-9表达水平与其启动子CpG岛甲基化水平呈负相关，进一步在组织标本中研究，发现高甲基化与较高的淋巴结转移率相关；Lujambio等［28］在207例结直肠癌病例中同样证实了此观点，即miR-9启动子高甲基化提示不良预后。Tang等［29］研究发现，与正常组织相比，结直肠癌组织中miR-345的CpG岛表现为高甲基化状态，其表达水平显著降低，深入研究揭示miR-345低表达与淋巴结转移以及较差的组织学类型存在相关性。几项不同研究均发现高表达miR-21与不良预后相关，表现为其在癌组织中表达高于正常组织，高表达与较高淋巴结阳性率、较高TNM分期以及远处转移相关［30-32］。Shibuya等［32］在156例配对结直肠癌和正常组织中检测miR-155表达，发现miR-155表达水平与无病生存率以及总生存率呈负相关，高表达与较高淋巴结转移率相关，提示预后不良。Akcakaya等［33］通过芯片筛选，比较不同预后两组结直肠癌组织中miRNA表达情况，发现高表达miR-185以及低表达miR-133b与预后不良相关，表现为较短的总生存和较高的远处转移率，提示两者可以作为结直肠癌根治术后预后判断的指标，从而更好指导临床实践。

3.3 化疗疗效预测

Nakajima等［34］研究46例复发或者带瘤生存的患者结直肠癌组织以及21例配对正常组织中的hsa-let-7g和hsa-miR-181b表达情况，发现两者在结直肠癌组织中表达均高于正常组织，相比高表达者，低表达者对S1有较好的化疗疗效，但对总生存无影响。Rossi等［35］通过体外实验观察到，抗代谢药物5-FU能诱导结肠癌细胞株HCT-116和HT-29部分miRNA表达改变，包括miR-200b在内的3种miRNA表达下调 和包含miR-21在内的19种miRNA表达上调。由于目前许多miRNA的靶基因尚不明确，只能通过网站(picTar、targetScan等)和生物信息学整合来预测，目标范围较广，而抗肿瘤药物诱导miRNA表达改变以及miRNA改变化疗敏感性的作用机制尚不清楚，故还需要进一步研究。

4 总结

miRNA在肿瘤的发生、发展中所扮演的角色受到越来越多研究者的关注，结合表观遗传学探讨其表达调节也是当前研究热点。然而，大部分研究发现仅是一种宏观上的较小样本量回顾性分析，缺乏前瞻性研究以及体外细胞株功能论证等证据，故将miRNA以及甲基化的研究结果大范围地应用于临床实践为时尚早。

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