胶体金法结合涂片形态学特征快速鉴别结核分枝杆菌复合群的应用评价

黄明翔 张丽水 陈新朝 毛文捷

我国是结核病高负担国家之一，患病人群数量巨大，面临着严峻的结核病流行形势［1］。同时，近年来由于气候、环境等因素，非结核分枝杆菌（non－tuberculosis Mycobacterium，NTM）感染具有明显的上升趋势，2000年调查表明，我国NTM菌株占全部分枝杆菌菌株的11.1%［2］，较1984—1985年的4.2%，1990年的4.9%明显增高。非结核分枝杆菌感染的临床症状和X线表现与结核相似，难以鉴别，且多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性，因此正确鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌对于疾病的诊断和治疗至关重要［3］。

传统的微生物学鉴定方法过于复杂、费时，而分子生物学鉴定方法由于仪器、试剂价格昂贵，也难以在日常的实践中推广。临床迫切需要一种快速、简易鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的方法。本研究运用涂片抗酸染色和结核分枝杆菌抗原胶体金法，对BACTEC MGIT 960培养阳性853株临床分离株进行菌种鉴定并与传统生化鉴定方法比较，以评价这两种方法在分枝杆菌菌种鉴定中的作用。

材料和方法

一、标本及菌株来源

标本来源于我院2011年1—6月门诊及住院肺结核或疑似患者，选择门诊及住院的肺结核患者或是咳嗽、咯痰≥2周或有咯血或血痰者等具有肺结核可疑症状者为研究人群，所有确诊及疑似肺结核患者的诊断均根据《结核病分类》（WS196－2001）中的诊断标准［4］执行。共收集1260例确诊肺结核患者和1350例疑似患者的标本进行结核分枝杆菌培养。2610例送检培养的标本中痰标本1580例，肺泡灌洗液921例，胸腔积液109例。经BACTEC MGIT 960培养共收集培养阳性，抗酸染色证实为分枝杆菌菌株853株。质控菌株：结核分枝杆菌标准菌株 H37Rv（ATCC27294）、偶然分枝杆菌（ATCC6841）来源于北京胸科医院国家参比实验室。

二、仪器和试剂

BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测仪及配套试剂为美国BD公司生产。ABI7300荧光定量扩增仪为美国应用生物（Applied Biosystems）公司生产、结核分枝杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司生产。抗酸染色液、改良酸性罗氏培养基、对硝基苯甲酸（PNB）、噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基及生化鉴定的试剂为本实验室参照中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》［5］自配。结核分枝杆菌胶体金检测试剂盒购自杭州创新生物检控技术有限公司。

三、实验方法

（一）分枝杆菌培养和涂片检查

送检标本经2～3倍消化液（30 mmol N－乙酰基L－半胱氨酸＋2%氧化钠＋2%柠檬酸三钠）消化处理15 min后，加生理盐水稀释至50 ml，4200转/min（离心半径15 cm）离心20 min后，弃去上清，用2～3 ml生理盐水稀释沉淀物，取约50μl接种到BACTEC MGIT 960培养管。一旦有阳性，系统会报告，从培养管里取样做抗酸染色，在1000倍普通光学显微镜下观察和记录。

（二）传统菌种鉴定实验

1.结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌传统生化鉴定实验：应用PNB和TCH鉴别培养基生长实验对菌种进行初步鉴定，操作步骤参照《结核病诊断细菌学检验规程》［5］进行。鉴定结果：结核分枝杆菌复合群PNB阴性TCH阳性；非结核分枝杆菌PNB阳性TCH阳性。

2.分枝杆菌菌种鉴定实验：按照中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》［6］的方法进行。

（三）结核分枝杆菌复合群实时荧光定量PCR鉴定

1.操作步骤：取1 ml混匀后的培养菌液，15 000 r/min（离心半径8 cm），离心5 min，弃上清，沉淀加无菌生理盐水1 ml打匀15 000转/min（离心半径8 cm），离心5 min，再重复1次，沉淀加50μl DNA提取液，置沸水浴10 min。10 000 r/min（离心半径8 cm），离心5 min，取上清液2μl，加入成品的结核分枝杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒中（包含引物、耐热DNA聚合酶、四种核苷酸单体等），按仪器说明进行PCR反应。

2.结果判定：依照说明书设定阴性质控品扩增循环数（Ct值）为≥30，临界阳性质控品Ct值为27～29，强阳性质控品Ct值为＜22。当阴性质控品Ct值＞临界阳性质控品Ct值＞强阳性质控品Ct值时，判定实验有效，在此前提下根据检测标本的Ct值判定结果，如果检测标本的Ct值≥30则判定为阴性，Ct值＜30则为阳性。

（四）结核分枝杆菌抗原胶体金法快速诊断实验

从培养阳性MGIT 960试管中取100μl样品加入结核分枝杆菌胶体金检测试剂盒的检测孔中，15 min后观察结果。结果判定：检测区和控制区均出现紫红色条带为阳性结果，在控制区出现紫红色条带，在检测区未出现为阴性结果。控制区未出现任何条带需重新检测。

四、统计学方法

采用敏感度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）评价实验方法阳性的有效性。敏感度＝真阳性/（真阳性＋假阴性）；特异度＝真阴性/（真阴性＋假阳性）；PPV＝真阳性/（真阳性＋假阳性）；NPV＝真阴性/（真阴性＋假阴性）。

结 果

一、BACTEC MGIT 960培养及鉴定结果

2610例临床标本BACTEC960培养阳性，经抗酸染色证实为分枝杆菌853株（32.7%）。经过传统生化反应鉴定其中结核分枝杆菌复合群760株，非结核分枝杆菌91株，结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌混合生长2株。鉴定结果见表1。

表1 传统生化反应对853株菌种分类的鉴定结果

图1～4 液体培养基沉淀物涂片抗酸染色形态。图1示结核分枝杆菌复合群呈典型索状生长（抗酸染色 ×1000）；图2示龟分枝杆菌呈团块排列（抗酸染色 ×1000）；图3示鸟－胞内分枝杆菌复合体呈团块排列（抗酸染色 ×1000）；图4示脓肿分枝杆菌呈散在分布（抗酸染色 ×1000）

二、BACTEC MGIT 960中分枝杆菌涂片抗酸染色结果

经传统生化方法鉴定为结核分枝杆菌复合群760株中，经吸取液体培养基沉淀物涂片抗酸染色呈索状排列的有748株，非索状排列的12株，其中束状排列10株，成团排列2株。非结核分枝杆菌则呈现团块状排列、散在分布等不规则排列，3株非结核分枝杆菌包括戈登分枝杆菌1株、偶然分枝杆菌2株呈索状排列。2株混合生长菌株则同时存在索状和非索状排列的情况。涂片法鉴别结核分枝杆菌敏感度为98.4%（750/762），特异度为96.7%（88/91）。PPV为99.6%（750/753）；NPV为88.0%（88/100）。详见图1～4及表2。

三、实时荧光定量PCR鉴定结果

760株结核分枝杆菌复合群和2株混合生长株实时荧光定量PCR检测结果均为阳性；91株非结核分枝杆菌为阴性。

四、结核分枝杆菌复合群抗原胶体金试验检测结果

具体见表3。752株结核分枝杆菌复合群和2株混合生长菌株胶体金试验呈阳性反应，8株结核分枝杆菌复合群呈阴性反应并重复3次试验仍然呈阴性反应；91例非结核分枝杆菌中90例呈阴性反应，1例鸟胞复合体呈弱阳性反应，该株同样经过3次重复试验结果均为弱阳性。胶体金试验鉴别结核分枝杆菌敏感度为 99.0% （754/762），特 异 度 为98.9%（90/91），PPV 为99.9%（754/755），NPV为91.8%（90/98）。

五、结合涂片抗酸染色和胶体金试验两种方法鉴别结核分枝杆菌的结果

结合两种方法对MGIT 960培养阳性菌株进行判断，当菌株涂片呈索状且胶体金阳性时即可判定该菌株含有结核分枝杆菌复合群，PPV为100.0%（741/741）；当菌株涂片不呈索状且胶体金阴性时可判定该菌株为非结核分枝杆菌，NPV 100.0%（87/87）；当只有其中一种方法阳性时，则需通过传统PNB法或分子生物学方法进一步进行判断（表4）。

表2 760株结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌抗酸染色检测菌落排列形态（株）

表3 BACTEC MGIT 960培养阳性分离株胶体金试验检测结果（株）

表4 结合涂片抗酸染色和胶体金试验两种检测方法鉴别结核分枝杆菌的结果（株）

讨 论

BACTEC MGIT 960系统是一种基于液体培养基的分枝杆菌快速培养系统，针对其阳性培养物的鉴定，目前国内实验室主要还是采用传统的鉴定方法，但所需时间长，不能满足临床快速诊断的需求。近年来兴起的分子生物学技术对实验室的仪器、实验人员的能力要求较高，试剂成本昂贵，很难在基层医院推广。临床急需一种快速简便、准确性高的方法。

在液体培养基中，结核分枝杆菌因含索状生长因子而在显微镜下呈现特有的索状排列，而非结核分枝杆菌则较少存在索状因子故呈现团块状排列、散在分布等不典型形态，因此索状排列形态被推荐作为一种结核分枝杆菌复合群的鉴定标准［7］。对于BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养系统报告阳性的菌株应立即进行涂片抗酸染色，不但可以排除非抗酸菌引起的污染，而且可以通过镜下形态特征能够对菌种类型进行初步判断。本研究结果显示，快速涂片鉴定的敏感度为98.4%，特异度为96.7%，具有良好的初步判断能力。国外有研究报道［8］，应用该法鉴定结核分枝杆菌复合群的敏感度、特异度分别为92.1%和96.4%，与本研究结果相近。

结核分枝杆菌抗原胶体金法是一种用单克隆抗体检测结核分枝杆菌分泌的MPT64（也称“MPB64”）蛋白的方法，MPT64蛋白主要存在于结核分枝杆菌复合群，非结核分枝杆菌中仅有极少数存在［9］。该方法快速，简便，不需要特殊的仪器，只需15 min便能得到结果，而传统的PNB生长试验需要4周时间。近年来，国内外许多学者均报道了应用该法快速鉴定结核分枝杆菌复合群。如Hillemann等［10］研究表明胶体金法检测结核分枝杆菌复合群的敏感度为92.4%，特异度为100.0%；国内陈俊林等［11］利用此法对131株分枝杆菌临床分离株进行检测，其敏感度为99.1%，特异度为100.0%。在本研究中通过对853株临床分离株进行检测，结核分枝杆菌抗原胶体金法的敏感度为99.0%，特异度为98.9%，PPV为99.9%，NPV 为91.8%，与报道基本相符。其中，8株结核分枝杆菌分离株呈阴性反应，它们可能存在MPT64编码基因突变［12］；另外，1株鸟胞复合体呈弱阳性反应，这株特殊的菌株经过菌种复苏后重新检测仍呈阳性反应，同时该株的实时荧光定量PCR检测结果为阴性，表明该菌株中不存在结核分枝杆菌复合群。国外多个文献也报道了该法对于不同种类非结核分枝杆菌呈假阳性反应的结果［13－14］，其原因还有待于进一步研究。

本研究显示，单一使用涂片法或胶体金法进行鉴定，都有可能出现漏诊或误诊的现象，而结合两种方法进行判断则可大幅度提升诊断的准确程度。当阳性培养物涂片显示索状排列且胶体金阳性时，可报告菌株中含有结核分枝杆菌复合群，其阳性预测值为100.0%；两种方法均为阴性，可报告为非结核分枝杆菌，其阴性预测值为100.0%；而只有任一种方法阳性，则需进一步鉴定。通过结合涂片法和胶体金法两种方法，853株菌株中97.1%（828株）得到快速鉴定，仅有25株需要进一步鉴定，极大提高了检验效率。

另外，需要提到的是91株非结核分枝杆菌中有1株耻垢分枝杆菌，由于本院对于初步鉴定为非结核分枝杆菌的标本都要求患者再次送检，经过鉴定两次送检的标本均为耻垢分枝杆菌，因此可以排除实验操作、标本留取过程中的污染。同时，病历资料显示该患者并没有处于免疫状态极其低下的状况，故考虑该菌为患者体内定植的非致病性细菌。

综上所述，无论是涂片法还是胶体金法，都是快速、简便的方法，两种方法的结合，可提高诊断的准确性，可作为分枝杆菌菌种鉴定的有效方法，且适于各级实验室使用。

［1］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，34（8）：485－508.

［2］全国结核病流行病学抽样调查技术指导小组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2002，24（2）：102－106.

［3］Katoch VM.Newer diagnostic techniques for tuberculosis.Indian J Med Res，2004，120（4）：418－428.

［4］中华人民共和国卫生部.WS196－2001结核病分类.北京：中国标准出版社，2002.

［5］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志，1996，18（1）：28－31.

［6］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志，1996，18（2）：80－85.

［7］Attorri S，Dunbar S，Clarridge JE 3rd.Assessment of morphology for rapid presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium kansasii.J Clin Microbiol，2000，38（4）：1426－1429.

［8］Tu HZ，Chang SH，Huang TS，et al.Microscopic morphology in smears prepared from MGIT broth medium for rapid presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex，Mycobacterium avium complex and Mycobacterium kansasii.Ann Clin Lab Sci，2003，33（2）：179－183.

［9］Bai Y，Xue Y，Gao H，et al.Expression and purification of Mycobacterium tuberculosis ESAT－6 and MPT64 fusion protein and its immunoprophy lactic potential in mouse model.Protein Expr Purif，2008，59（2）：189－196.

［10］Hillemann D，Rüsch－Gerdes S，Richter E.Application of the Capilia TB assay for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex isolates.Int J Tuberc Lung Dis，2005，9（12）：1409－1411.

［11］陈俊林，顾欣荣，顾德林，等，结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨.医学综述，2009，15（18）：2847－2848.

［12］Hirano K，Aono A，Takahashi M，et al.Mutations including IS6110 insertion in the gene encoding the MPB64 protein of Capilia TB－negative Mycobacterium tuberculosis isolates.Clin Microbiol，2004，42（1）：390－392.

［13］Wang JY，Lee LN，Lai HC，et al.Performance assessment of the Capilia TB assay and the BD Probe Tec ET system for rapid culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis.Diagn Microbiol Infect Dis，2007，59（4）：395－399.

［14］Abe C，Hirano K，Tomiyama T.Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti－MPB64 monoclonal antibodies.J Clin Microbiol，1999，37（11）：3693－3697.