胆固醇转运蛋白NPC1L1的研究进展

张艳平，许崇利，刘 霞，高 飞，武 蓉，欧阳红生，逄大新，许崇波

（1.大连大学医学院，辽宁大连1166222；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062；3.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林吉林 132022；4.南京师范大学生命科学院，江苏南京 210046）

胆固醇在机体内有着广泛的生理作用，它不仅参与细胞膜形成，而且是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的原料。胆固醇分为高密度胆固醇和低密度胆固醇两种，前者对心血管有保护作用，通常称之为“好胆固醇”；后者偏高，冠心病的危险性就会增加，通常称之为“坏胆固醇”。随着人们生活水平的不断提高，动脉粥样硬化和冠心病成为当前威胁人类健康的两大常见疾病，其最突出的致病因素是血脂异常，主要的生物化学标志是过量的“坏胆固醇”就像小米粥一样在动脉壁上沉积，导致管壁硬化、管腔狭窄。其发病机制是机体内的巨噬细胞和平滑肌细胞吞噬脂质后形成泡沫化细胞。人体内胆固醇的来源主要通过自身细胞的合成和吸收膳食及胆汁中的胆固醇两个途径， 胆固醇的清除主要通过合成胆汁酸和从胆汁排泄这两个途径。NPC1L1目前已被证实是细胞内胆固醇和植物胆固醇吸收的关键蛋白，它也是新型的降脂药物依泽替米贝的作用靶点。

1 NPC1L1的发现与结构

2004年Altmann等[1]通过染色体生物信息系统证实了药物的分子学机制， 其作用靶点是胆固醇吸收蛋白 Niemann-Pick C1 Like 1，NPC1L1，它的氨基酸结构有42%与Niemann Pick C1（NPC1）型蛋白相同，这也是它名称的来源。NPC1蛋白是细胞内胆固醇转运的载体，是常染色体隐性遗传的致命性脂质沉积和神经变性Niemann Pick病C1型的病因[2]。NPC1的功能缺陷将导致C型尼曼匹克病的发生，作为常染色体隐形脂质蓄积遗传病，该病呈多样性，多发于婴幼儿时期、导致患病者20岁之前就死亡的典型青少年疾病。患病儿童常表现为各种异常的神经症状：精神紊乱、猝倒、麻痹、中风等。

人类NPC1L1基因位于染色体7p13，具有20个外显子和19个内含子，其中2个大的外显子分别由1 526 bp组成，14个小的外显子分别由56 bp组成，全长cDNA编码1 359个氨基酸，氨基酸序列与NPC1有51%相似，42%相同，两者的二级结构相似[3-4、11、13]。NPC1L1是一个多次跨膜蛋白，含有13个跨膜结构，其中（氨基端起第3至7）5个跨膜结构（约180个氨基酸）组成了中间的固醇敏感结构域（SSD），该结构域在其他胆固醇代谢调节蛋白的多次跨膜结构中也是保守存在的。比如NPC1、HMG-CoA还原酶、胆固醇生物合成途径的限速酶、固醇调节原件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）和Hedgehog补丁信号肽，SSD的功能有待被阐明，但它可能是通过感知膜上的胆固醇浓度来调节NPC1L1在细胞内的“旅游活动日程”[2，11]。NPC1L1有广泛的糖基化位点，在它的氨基端胞外环状部分具有NPC1蛋白家族特征性的保守氨基酸序列NPC1结构域，该序列在所有的NPC1同源物中是高度保守的，在（氨基端起）第9和10个跨膜结构之间是一个富含半胱氨酸的环状结构，在第5和6跨膜结构之间有个YQRL模体，第7和8结构之间有个YAPF模体，这两个模体可能与促进膜表面脂质的内吞作用有关[3-5]。NPC1L1没有NPC1蛋白结构中的羧基末端消化定位模体LINF，LINF负责传送包含体/溶酶体系统的信号[4，11]。

2 NPC1L1的组织分布

NPC1L1的表达分布具有物种差异性，其在不同物种的小肠的表达量都比较丰富，但在啮齿类、人类、灵长类的组织中得表达量却明显不同，在啮齿类动物中的小肠高表达，而在人类和其他灵长类动物的肝脏表达量最高，其次是小肠[3，7]，在小肠和肝脏外的其他组织器官如胰腺、肾脏、肺、心脏及脑组织也有表达，但其表达量都不足小肠表达量的10%，NPC1L1的这种分布的物种差异性可能与物种进化程度和生存环境的长期选择有关[3，6，8]。另外，根据一项小鼠实验的研究报告，NPC1L1在肠内的表达也是不均匀的，在近空肠处和空肠处表达量最高，在回肠处表达量很低，这种表达差异性就很好的解释了为什么食物胆固醇在近空肠处和空肠处的吸收量高于其他部位。关于NPC1L1的亚细胞定位现在还存在很大的争议，但其定位是受胆固醇调控的。

3 NPC1L1在胆固醇和植物胆固醇吸收中的作用

目前普遍认为NPC1L1是胆固醇吸收的关键蛋白，可能的作用机制是位于膜表面NPC1L1的SSD区域与一定量的胆固醇结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用被转运到细胞内。当NPC1L1表达缺陷时小鼠胆固醇吸收下降量（＞70%）与降脂药物依泽替米贝的作用水平（降低68%～73%）相当，而且依泽替米贝也不能再进一步降低NPC1L1基因敲除小鼠的胆固醇吸收量，给NPC1L1基因敲除小鼠喂食高胆固醇食物后，小鼠未出现高脂血症和动脉粥样硬化症状。应用放射标记示踪技术和荧光分析证实， NPC1L1是依泽替米贝的靶蛋白，依泽替米贝通过与NPC1L1结合，抑制NPC1L1的转运功能而降低血脂[1，7，11]。Harry R.等[9]通过比较Wide-type、NPC1L1-/-、NPC1L1/ApoE-/-、ApoE-/-四型小鼠体内胆固醇的变化，研究NPC1L1表达缺陷是否能够抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发生时发现：与Widetype、ApoE-/-型相比，NPC1L1-/-、NPC1L1/ApoE-/-小鼠的胆固醇吸收量明显减少，为维持体内胆固醇含量的平衡后者胆固醇合成量会高于前者，同时前者体内具有降脂作用的酶HMG-CoA-Syn的mRNA量会明显高于后者。与用普通食物饲养的小鼠相比，用含高胆固醇食物饲养小鼠24周之后，Wide-type、ApoE-/-的血液胆固醇含量明显升高，而NPC1L1-/-、NPC1L1/ApoE-/-的血液胆固醇含量却没有变化，说明NPC1L1表达缺陷能够有效抑制高胆固醇食物饲养小鼠体内胆固醇的吸收，其抑制效果与低胆固醇食物饲养的小鼠相同。NPC1L1/ApoE-/-小鼠的主动脉、无名动脉内膜以及主动脉根部动脉粥样硬化病变面积分别比单纯ApoE-/-小鼠减少90%以上。以上结论均说明敲除ApoE-/-小鼠体内NPC1L1基因，或者用降脂药物依泽替米贝结合NPC1L1蛋白，都能够有效降低胆固醇水平，同时降低（极低密度脂蛋白）VLDL、（低密度脂蛋白）LDL，升高HDL（高密度脂蛋白）水平，进一步抑制动脉粥样硬化的发生。Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可以用来进行模拟体内肠转运的实验。敲除或者抑制Caco-2上皮细胞的NPC1L1基因，能够明显降低细胞的胆固醇摄取，降脂药物依泽替米贝也不能再降低这些细胞胆固醇的吸收能力，而能明显降低未基因敲除细胞的胆固醇吸收水平[10]。

研究发现NPC1L1在植物胆固醇吸收中也起着非常关键作用，人吸收的两类主要植物胆固醇是谷甾醇和菜油甾醇，每日吸收量大约为250mg，虽然健康人个体对胆固醇的平均吸收率为50%，但是对植物胆固醇的吸收率却只有5%。植物胆固醇在血液和组织中堆积能够引起罕见的常染色体隐性遗传病谷固醇血症。依泽替米贝能有效减少谷固醇血症病人植物胆固醇的堆积，NPC1L1基因敲除小鼠的胆固醇吸收量也明显减少，说明NPC1L1在植物胆固醇的吸收中也起着非常关键的作用[11-12]。

4 NPC1L1与ABCG5G8共同调控胆固醇转运

ABCG5和ABCG8是腺苷三磷酸结合盒转运体ATP binding cassette transport，ABC超家族G亚族的新成员，是一族依赖于ATP的跨膜转运蛋白。ABCG5G8和NPC1L1的组织分布一致，但却发挥着相反的功能，这两个蛋白调控胆固醇向细胞外流出，因此ABCG5G8和NPC1L1共同调控胆固醇在小肠的转运，小肠胆固醇的摄取量应该取决于NPC1L1的载入量减去ABCG5G8的载出量[4]。ABCG5G8功能缺陷可能会导致植物胆固醇诱发的谷固醇血症，ABCG5和ABCG8在植固醇血症病人中是不会同时突变的。沈振斌等[14]发现ABCG5和ABCG8转染后的人肝肿瘤细胞7721胆固醇转运能力有明显的增强，证明ABCG5和ABCG8在肝细胞胆固醇转运中起重要作用。当ABCG5单独导入7721细胞后胆固醇转运能力并没有出现明显改变，当细胞内同时导入ABCG5和ABCG8后胆固醇转运能力明显增加，提示ABCG5需要ABCG8共同发挥作用，两蛋白在发挥作用时可能形成功能性异二聚体。ABC转运体通过跨膜螺旋体区域结合到细胞膜上，只有同时具备2个核苷酸结合区域和2个螺旋跨膜区域的ABC转运体才具有活性。由于ABCG半转运体仅包括1个核苷酸结合区和1个螺旋跨膜区域，它们必须形成同二聚体或异二聚体发挥作用[15-16]。Kamisako等[17-18]也证实了ABCG5和ABCG8是肝脏有效向胆汁分泌胆固醇所必需的转运蛋白。

5 NPC1L1：降脂药物Ezetimibe的靶蛋白

依泽替米贝分子式为C24H21F2NO3，相对分子质量为409.42，化学名为1-（4氟苯基）-3R-[3-（4-氟苯基）-3（S）-羟苯基]-4（S）-（4-羟苯基）-2-丙内酰胺。在常温下稳定，极易溶于甲醇、乙醇、丙醇，熔点为163℃，它是一种新型高效胆固醇吸收抑制剂，作用于小肠刷状缘，通过抑制NPC1L1的功能而减少胆固醇的吸收，降低血浆胆固醇水平，进而有效阻止高脂血症的发生。但是，该药不影响啮齿类对甘油三酯、乙炔雌二醇、孕激素、牛磺胆酸和脂溶性胆固醇的吸收，也不影响人体对脂溶性维生素的吸收[19，21]。Altmann等[1]发现，依泽替米贝不能再进一步降低NPC1L1基因敲除小鼠的胆固醇吸收量。Garcia-Calvo等[20]用放射性配体结合技术发现，标记的依泽替米贝能特异性的结合在表达NPC1L1的位点，而无法与NPC1L1基因敲除小鼠的肠上皮细胞结合。另外，也有研究小组发现依泽替米贝可能还有其他的靶蛋白，比如氨肽酶NAPN，依泽替米贝通过与APN结合阻止富集胆固醇的膜质微区的胞吞作用，从而抑制小肠对胆固醇的摄取。

6 对NPC1L1的调控

6.1 Cdc42蛋白对NPC1L1的调控

Cdc42蛋白是Rho GTP酶家族中的一员，它是细胞内一种十分重要的蛋白质，担负着调节细胞骨架结构、细胞生长、细胞极性以及细胞内运输等多种功能。Xie Chang等[22]研究发现cdc42能与NPC1L1相互作用共同调控胆固醇的转运，cdc42基因突变或者敲除将抑制NPC1L1向质膜的转运，并干扰胆固醇调节的NPC1L1与Rab11a（成员RAS原癌基因家族）、MyoVb（肌球蛋白Vb）、肌动蛋白的结合，NPC1L1无法完成在cdc42基因敲除小鼠胆小管的定位和胆汁胆固醇的有效再吸收。

6.2 SREBP2对NPC1L1的调控

当细胞内胆固醇水平降低时， 甾醇调控元件结合蛋白2SREBP2被激活，上调细胞NPC1L1mRNA和蛋白的表达。Alrefai等[23]在Caco-2实验发现，SREBP2在人NPC1L1启动子处与ACAT2、PLTP两个固醇调节原件结合，激活NPC1L1启动子的活性，增强NPC1L1蛋白的表达。Pramfalk等[24]在HuH7细胞中也证实了这一现象。

6.3 HNF4α对NPC1L1的调控

肝细胞核因子4α（HNF4α）是核受体超家族中一种单一受体，广泛表达于人体各个器官，是脂质代谢的关键调节因子。HNF4α基因敲除小鼠NPC1L1mRNA的表达显著减少。因此，HNF4α对人NPC1L1基因表达有重要的调节作用。同时微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）是VLDL装配和分泌过程的限速酶，也是HNF4α的靶基因[3]。

6.4 肝X受体对NPC1L1的调控

肝X受体（liver X receptors，LXRs）是核受体超家族的成员，一种体内胆固醇感受器，人为抑制肝脏X受体活性将导致NPC1L1表达明显降低。当细胞内胆固醇浓度升高时，LXR激活并导致小肠上皮细胞的NPC1L1mRNA和蛋白表达下调。LXR可能是固醇感受器，直接把信号传递给NPC1L1，再通过NPC1L1摄取固醇类脂质，然而具体机制仍不清楚[25-27]。

7 前景展望

动脉粥样硬化是西方发达国家主要死亡原因。随着我国人民生活水平提高和饮食习惯改变，该病也逐步成为我国主要死亡病例。动脉粥样硬化始发儿童时期而持续进展，通常在中年或者中老年出现症状。NPC1L1被认为是固醇类脂质吸收的关键蛋白，也是降脂药物依泽替米贝的靶蛋白，在调控胆固醇在体内的代谢平衡中起到了重要作用，同时也能预防动脉粥样硬化及其他高脂血症的发生。近年来对NPC1L1的研究逐渐深入，对于全面了解脂类代谢、治疗高脂血症具有极其重要的意义。

[1]Altmann S W，Davis Jr H R，Zhu L J. Niemann-Pick C1 Like 1 Protein Is Critical for Intestinal Cholesterol Absorption[J].Science，2004，303（5661）：1201-1204.

[2]Betters J L，Yu L Q.NPC1L1 and Cholesterol Transport[J].FEBS Lett. 2010，584（13）：2740-2754.

[3]Davies J P，Brynn L， IoannouY A. Evidence for a Niemann–Pick C NPC Gene Family：Identification and Characterization of NPC1L1[J]. Genomics，2000，65（2）：137-145.

[4]Haruaki N. Niemann-Pick C1-Like 1：A Key Player in Intestinal Cholesterol Absorption[J]. Yonago Acta medica，2010，53（2）：29-36.

[5]Kwon1 H J， Palnitkar M， Deisenhofer J. The Structure of the NPC1L1 N-Terminal Domain in a Closed Conformation[J]. PLoS ONE，2011，6（4）：e18722.

[6]朱雁飞，李幼生，黎介寿.Niemann-Pick C1 Like 1研究新进展[J].肠外与肠内营养，2009，16（6）：373-376.

[7]Ahmed M H，Byrne C D.Potential therapeutic uses for ezetimibe beyond lowering LDL-c to decrease cardiovascular events. Diabetes[J]. Obesity and Metabolism，2010，12（11）：958-966.

[8]李辉，刘德平.胆固醇吸收蛋白-降脂治疗的新靶点[J].中国心血管杂志，2008，13（4）：311-313.

[9]Davis Jr H R， Hoos L M， Tetzloff G， et al. Deficiency of Niemann-Pick C1 Like 1 Prevents Atherosclerosis in ApoE-/-Mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol ，2007，27（4）：841-849.

[10]Huang Y， ZhengY C. The probiotic Lactobacillus acidophilus reduces cholesterol absorption through the down-regulation of Niemann-Pick C1-like 1 in Caco-2 cells[J]. British Journal of Nutrition，2010，103（4），473-478.

[11]Jia L， Betters J L， Yu L Q. Niemann-Pick C1-Like 1NPC1L1 Protein in Intestinal and Hepatic Cholesterol Transport[J]. Annu.Rev. Physiol，2011（73）：239-259.

[12]Davis H R， Zhu L J， Hoos L M， et al. Niemann-Pick C1 Like 1NPC1L1 is the intestinal phytosterol and cholesterol transporter and a key modulator of whole-body cholesterol homeostasis[J]. J Biol Chem，2004，279（32）：33586-33592.

[13]张新波，王绿娅. 新型胆固醇吸收抑制剂Ezetimibe的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学， 2007，12（3）：258-261.

[14]沈振斌，秦新裕，童赛雄，等. ABCG5和ABCG8在肝细胞胆固醇转运中的作用[J].中华肝胆外科杂志，2005，11（10）：695-697.

[15]Dean M，Hamon Y，Chimini G. The human ATP binding cassetteABC transporter superfamily[J]. Lipid Res.2001，42（7）：1007-1017.

[16]Fitzgerald M L， Mendez A J， Moore K J，et al. ABCA1 contains an N-terminal signal-anchor sequence that translocates the protein，s fi rst hydrophilic domain to the exoplasmic space[J]. Biol Chem，2001，276（18）：15137-15145.

[17]Graf G A， Li W P，Gerard R D，et al. Coexpression of ATP-binding cassette proteins ABCG5 and ABCG8 permits their transport to the apical surface[J]. J Clin Invest，2002，110（5）：659-669.

[18]Kamisako T，Ogawa H. Regulation of biliary cholesterol secretion is associated with ABCG5 and ABCG8 expressions in the rats ：effects of diosgenin and ethinyl estradiol [J]. Hepatol Res，2003，26（4）：348-352.

[19]何娟， 阳学风.依泽替米贝的降脂作用及其作用机制的探讨[J].中国心血管病研究，2007，5（10）：783-785.

[20]Garcia-Calvo M，Lisnock J，Bull H G，et al. The target of ezetimibe is Niemann-Pick C1-Like 1 NPC1L1 [J]. PNAS，2005，102（23）：8132-8137.

[21]Davis Jr H R， Lowe R S， Neff D R. Effects of ezetimibe on atherosclerosis in preclinical models[J]. Atherosclerosis，2011，215（2）：266-278.

[22]Xie C，Li N， Chen Z J，et al.The small GTPase Cdc42 interacts with Niemann-Pick C1 Like 1 NPC1L1 and controls its movement from endocytic recycling compartment to plasma membrane in a cholesterol dependent manner[J]. J Biol Chem，2011，286（41）：35933-35942.

[23]Alrefai W A， Annaba F， Sarwar Z，et al. Modulation of human Niemann- PickC1-like 1 gene expression by sterol： role of sterol regulatory element binding protein 2[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2007， 292（1）：369-376.

[24]Pramfalk C，Jiang Z Y，Cai Q， et al. HNF1αand SREBP2 are important regulators of NPC1L1 in human liver[J]. Lipid Res.2010（51）：1354-1362.

[25]刘飞，黄迪南，侯敢.NPC1L1：固醇脂质吸收的关键蛋白质[J]. 生命的化学，2006，26（5）：389-391.

[26]唐蔚青， 李红霞， 满永. Niemann-Pick C1-Like1表达缺陷缓解肝X受体激动剂诱导的小鼠肝脏脂肪性变[J].中国动脉硬化杂志，2008，16（12）：953-956.

[27]黄锋，杜冠华.新的药物靶点肝X受体[J].食品与药品，2011，11（5）：46-50.