基因芯片技术在针灸领域的应用和研究现状*

韩 科，杨咏红，樊小农，王 舒，张俊清，牟 蛟，张 超，焦 洋，赵 帅，孟智宏△

(1.天津中医药大学，天津300193;2.济南市第五人民医院，山东济南250000; 3.天津市针灸研究所天津市针灸学重点实验室，天津300193;4.天津中医药大学第一附属医院，天津300193)

综述

基因芯片技术在针灸领域的应用和研究现状*

韩 科1，杨咏红2，樊小农3，王 舒4，张俊清1，牟 蛟1，张 超1，焦 洋1，赵 帅1，孟智宏4△

(1.天津中医药大学，天津300193;2.济南市第五人民医院，山东济南250000; 3.天津市针灸研究所天津市针灸学重点实验室，天津300193;4.天津中医药大学第一附属医院，天津300193)

基因芯片技术在针灸机理研究中应用越来越广，与中医针灸经典理论相结合，从分子水平上全面而深刻的探究了针灸的作用机制，体现了针灸治病的整体调节作用。本研究从针灸的临床和基础研究的角度综述了基因芯片技术在针灸领域中的应用和取得的研究成果。

针灸;基因芯片;临床应用

基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，也常被称作DNA微阵列或DNA微阵列芯片，最早是由E.southern在1989年提出，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列在固象支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息［1］。基因芯片技术是基因功能研究中最伟大的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多学科领域的成就，具有其高通量、大规模、高度平行性、快速高效、高灵敏度、高度自动化等优点，应用研究已深入到医学各生命学科中，当然针灸也不例外。

目前，基因芯片技术已用于针灸领域的研究中，并积累了一定的资料。通过观察不同经脉的穴位、不同的干预方法等影响针刺效应的因素，寻找出相关组织基因表达的差异。从分子水平上深化和发展了中医对经络现象、腧穴的特异性、经脉－脏腑相关的认识。为总结针灸领域研究应用该技术的经验和成果，本文从临床和基础实验研究角度，对国内近10年来基因芯片技术在针灸领域中的研究应用评述如下。

1 基因芯片在针灸临床应用研究

针灸临床疗效在世界范围内被广泛认可，但针灸的治疗疾病的科学机理研究至今尚未明了。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段，可以在一次试验中同时对成千上万个基因进行分析。针刺可引起人体多系统、多功能的同步变化，符合中医治疗疾病的整体观念思想，因此通过观察不同穴位、时间、频率、刺激强度、刺激方法等导致有关组织基因转录表达上的差异，从分子水平全面而深刻探明针刺的作用机制，体现针灸的整体调节作用［2］。

谭从娥等［3］选取典型肾阳虚证患者10名给予温针治疗两周，然后以其中疗效最好的4例治疗前后作基因芯片杂交测试，筛选出32个显著表达基因，基因功能注释结果提示炎症反应、信号转导类基因显著表达;分子通路主要集中于免疫及信号转导通路。由此可以看出，温针灸能通过影响多靶点和疾病过程的多个环节来激发机体自身内在的调整能力而达到治疗目的，也提示温针疗效的生物学基础是多方面的，涉及到炎症反应、免疫功能、信号系统等多方面的基因表达。杨丽萍等［4］在上述实验的基础上，初步研究了得出肾阳虚证骨关节炎的发生主要涉及13条免疫相关基因表达的异常，经温针治疗前后的基因芯片比较结果显示:NM000265、NM001838基因普遍上调，NM001784基因普遍下调，其他基因表达无规律性变化，初步认为温针灸可能通过诱导或阻遏和免疫相关的基因的表达发挥效应。

丁汉荣等［5］筛选出符合西医膝骨关节炎和中医肾阳虚证诊断标准的患者两组，每组8例，与8例正常对照组比较。结果显示，两张芯片各获得162和75条差异表达基因，其中与信号转导相关的分别为26条和11条;两张芯片共同差异表达基因6条，与信号相关的有3条，占总数的1/2。试验结果差异表达基因涉及到多个信号转导通路，最重要的有3条;JAK－STAT信号转导通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号转导通路、丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。通过研究认为，机体信号转导异常特别是神经内分泌免疫系统可能是肾阳虚骨关节炎发病的分子生物学基础，细胞间信号转导异常也可能在肾阳虚证骨关节炎的发生、发展过程中起着重要作用。

2 基因芯片在针灸基础应用研究

基因芯片技术在基础研究中所选对象仍以实验动物为主，现对针灸治疗脑梗塞、溃疡性结肠炎、急性心肌缺血、脊髓损伤、类风湿性关节炎等疾病机理，以及经穴脏腑相关性、抗衰老、抗脑缺氧机理进行了研究。其中对抗衰老、脑梗塞、溃疡性结肠炎、经穴脏腑相关性机理研究较多。根据干预方法的不同，概括总结了基因芯片技术在上述疾病机理研究中运用概况。

2.1 传统针刺

王米渠等［6］应用基因芯片技术研究了针刺D－半乳糖所致衰老大鼠涌泉穴对衰老模型大鼠基因表达的影响，初步筛选出了318条差异表达基因，并对其中差异最为显著的55条作了初步分析，结果表明了针刺对基因表达的影响涉及免疫、基础代谢、生长发育等多方面基因的表达。张卫等［7］通过针刺亚急性衰老大鼠的涌泉穴，研究针刺对亚急性衰老大鼠蛋白质合成相关基因表达的影响，初步了解到针刺能够调节衰老过程中与蛋白质合成相关基因的表达量，调节机体蛋白质的含量与组成比例，起到改善机体功能状态延缓衰老的作用。丁晓蓉等［8］通过针刺快速老化小鼠(SAMP10)膻中、中脘、气海、血海、足三里穴位，观察到P10海马共有7类10个基因的表达发生变化，8个基因表达下调，2个基因表达上调，所有与SAMP10快速老化相关基因的表达均被部分或全部的逆转。说明针刺上述穴位能够良性调节脑老化相关基因的表达，并可能通过该种作用延缓脑衰老。张占军等［9］应用基因表达谱芯片筛选出局灶性脑缺血大鼠脑相关基因211个，其中12个基因低表达，199个基因高表达，它们中有相当部分被证实为新的局灶性脑缺血相关基因。庄明华等［10］快针浅刺新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型的督脉穴(百会、天门、大椎和脊中)、任脉穴(关元、中腕、膻中和承浆)、膀胱经穴(肺俞、心俞、脾俞和肾俞)14天后，大脑皮质基因共有48条基因与对照组有表达差异，其中40条基因上调，8条基因下调，得出针刺对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠大脑皮质多种神经营养因子及受体基因的表达有调节作用，这可能介导了针刺治疗缺血缺氧性脑病的分子机制。

2.2 艾灸

尹海燕等［11］选用艾灸百会和命门寻找与艾灸有关的老年学习记忆减退大鼠海马干细胞相关的基因靶点，重点靶点可能主要在于Fgf、Tgf、Wnt和Sox家族。张燕等［12～13］艾灸18月龄wistar老年大鼠命门穴，显示抗衰老的分子机制主要与炎性反应基因有关，老年组/年轻组中上调的22条炎性反应基因中有14条基因在灸疗组/年轻组中正常表达，有5条基因在灸疗组/年轻组中趋于正常表达，灸命门穴通过良性调节19条炎性反应基因从而延缓老年大鼠衰老;而在大鼠衰老的抗氧化机制中老年组与年轻组中涉及氧和活性氧中间产物参与新陈代谢的过程的9条基因下调，经过灸命门穴位治疗后，有8条基因在灸疗组与年轻组中正常表达，因此抗氧化可能是灸命门穴延缓老年大鼠衰老的机制之一。吴焕淦等［14］探讨隔药灸溃疡性结肠炎模型大鼠“天枢”穴治疗溃疡性结肠炎的作用机理，筛选出在溃疡性结肠炎大鼠结肠中异常表达、隔药灸治疗后得到调节的差异表达基因174条，其中28条(含已知基因7条)在溃疡性结肠炎大鼠中表达下调的基因经隔药灸治疗后表达升高，146条(已知基因42条)上调基因经隔药灸治疗后表达降低。得出隔药灸可通过调节IL－1βmRNA等诸多基因的表达，起到治疗作用。杨馨等［15～16］观察艾灸双侧“肾俞”，对实验性类风湿性关节炎(RA)家兔滑膜细胞JAK－STAT信号通路、MAPK信号通路异常激活有明显抑制作用，上述两条信号转导通路都直接或间接参与了体内细胞的炎性反应，因此艾灸具有抗炎消肿的作用。

2.3 电针

曲怡等［17］用大鼠全基因组寡核苷酸微阵列芯片检测电针“水沟”、“百会”穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑基因表达谱的影响，结果显示局灶性脑缺血再灌注大鼠与假手术组大鼠脑组织基因表达谱相比，有175个差异表达基因，其中115个基因表达增高，60个基因表达下调;电针组与局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织基因表达谱相比，有74个差异表达基因，其中26个基因表达增高，48个基因表达下调。这些基因大多与信号转导、氧化应激、生长代谢、细胞凋亡等密切相关。李梦等［18］从差异表达基因方面探讨心经经脉、肺经经脉与下丘脑相关的特异性分子基础，结果显示，电针心经与电针肺经比较，其在下丘脑中枢调节过程中具有相对特异性作用途径。说明经脉与脏腑之间存在着相对特异性的联系。陈慧群等［19］电针大鼠足三里穴调控胃运动的相关差异基因及其相关的部分信号转导通路，发现胃动过速较胃动过缓明显差异表达的标志基因hoxal、lep、bc－l上调，分别属于维甲酸通路、胰岛素通路、survival通路、雌激素通路、磷脂酶C通路;胃动过速较胃动过缓明显差异表达的标志基因ptgs2下调，属于磷脂酶C通路。结果为电针足三里穴对大鼠胃电具有双向调节作用，并以抑制作用为主。汪克明，吴子建等［20～21］揭示了电针对缺血心肌的保护机制和抗心肌缺血的分子作用途径。陈泽斌等［22］探讨针刺预处理抗脑缺血再灌注损伤作用的分子机制，分析得出20个基因表达差异具有显著性意义(P＜0.05)。其中8个基因表达上调，12个基因表达下调;涉及神经元信号传递类(离子通道、递质、受体、第二信使)基因11个，涉及转录调控类基因5个，涉及代谢酶类基因2个，涉及热休克反应类基因1个，涉及细胞骨架类基因1个。初步了解到针刺预处理后神经细胞功能状态的改变可能是其随后发挥抗脑缺血再灌注损伤作用的重要基础。有学者等［23～24］研究电针和针药结合治疗抑郁症的作用机理，以及两者的优缺点。发现抑郁症模型大鼠下调表达，而经电针治疗后表达趋于正常的基因有101条，其中多条基因与能量和物质代谢有关，还涉及蛋白质生物合成和嗅觉感受器等;抑郁症模型大鼠上调表达，而经电针治疗后表达趋于正常的基因有125条，其中多条基因与凝血、免疫、炎性反应和凋亡相关。电针和针药结合差异表达基因谱较为相似，针药结合的优势体现在强有效地下调凝血因子Ⅴ和5－羟色胺2C受体的表达说明电针和针药结合治疗抑郁症的机制与调控多条基因表达有关。

3 小结

综上所述，基因芯片技术在针灸学中应用越来越多，针灸治疗作用机理的研究也取得了一定的成绩。但目前研究所选用的对象仍然以实验动物为主，人体试验相对较少，人体的经络现象显然不完全等同于动物，因此，以人体为主要研究对象的研究应引起重视。对针灸作用机理的研究，应借鉴生命科学领域的先进的理论及技术，从影响基因的调控、表达，特别是表达产物的功能着手，研究吸收“功能基因组学”研究成果的基础上，充分发挥针灸擅于调节的特征，为针灸作用机理的阐述乃至经络俞穴本质的最终揭示，发挥重要作用。在“功能基因组”与“疾病基因组”的调控方面，针灸具有巨大的潜力，如果能在该方面有突破的话，将使我国针灸领域的相关研究成果在即将来临的“后基因时代”处于国际领先地位［25］。通过基因芯片的研究可能建立起不同针刺条件下，不同疾病的基因表达图谱，有助于从基因水平分析和筛选不同经脉相对特异性的基因，优化临床选穴标准，初步从分子水平上规范了临床针灸的治疗学标准，为针刺的基础和临床研究提供更加科学的规范，更好的指导临床，提高疗效。

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Application and Research of Genechip Technology in the Field of Acupuncture

HAN Ke1，YANG Yong－hong2，FAN Xiao－nong3，WANG Shu4，ZHANG Jun－qing1，MOU Jiao1，ZHANG Chao1，JIAO Yang1，ZHAO Shuai1，MENG Zhi－hong4△
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2.Jinan Fifth People’s Hospital，Jinan 250000，China; 3.Tianjin Acupuncture and Moxibustion Institute，Tianjin Acupuncture and Moxibustion Key Laboratory，Tianjin 300193，China; 4.First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China)

Genechip technology is more widely applied in the mechanism of acupuncture combined with the classical theory of acupuncture.The paper explores the mechanism of acupuncture comprehensively and profoundly in the level of molecular and reflects the overall regulation of acupuncture treatment.This paper summarizes the application and research of genechip technology in the clinic and basic research field of acupuncture.

Acupuncture;Genechips;Clinical application

R246

A

1005－0779(2012)007－0067－03

国家重点基础研究发展计划(“973计划”)资助，编号: 2010CB530506，2012CB518505。

韩科(1983－)，男，2009级针灸推拿专业博士研究生，主要从事针灸治疗脑血管病的临床和基础研究。

△通讯作者:孟智宏(1963－)，男，主任医师，博士研究生导师，主要从事心脑血管病的临床和基础研究。

2011－12－29