结核分枝杆菌利福平依赖性的初步研究

金海霞 付雷 王彬 郑梅琴 陆宇

20世纪60年代，国外文献报道了链霉素依赖的Mtb菌株，即菌株在含链霉素的培养基上生长较在不含药培养基上旺盛［1－2］。之后，又发现了“依赖RFP的 Mtb菌株”［3－4］。目前，除 RFP依赖 Mtb菌株外，还报道了 Mtb的INH、S、EMB依赖现象［5－8］。RFP自1971年发明以来，一直是治疗结核病的首选药物。资料显示，Mtb对RFP的依赖率最高。现阶段，无论在临床还是在实验室研究层面，Mtb药物依赖现象都还没有引起足够的重视。国内关于Mtb药物依赖现象的研究，大多数还仅停留于菌株的体外筛选，以及对该现象的简单描述。国外自20世纪50年代报道了链霉素的依赖现象后，尚未见新的报道。一些研究者利用豚鼠模型在体内观察RFP依赖菌株的依赖现象，但未观察到依赖菌株与非依赖菌株的差异［9］。有学者认为，依赖是在耐药基础上产生的，是量变到质变的过程，可能是耐药菌耐药基因进一步变异的结果［10］。目前研究表明，大多数RFP耐药是由于其靶分子RNA聚合酶β亚基（RpoB）的编码基因（rpoB）发生突变，阻止 mRNA合成所致［11－12］。目前，国内外已报道有 70 多个rpoB 基因突变位点［11－14］，95%以上集 中 在 一个被称为RFP耐药决定区的高度保守区内（507～533位），其中又以531、526和516位3个位点的突变最常见，约占所有耐 RFP Mtb基因突变位点的86%［11－12］。本研究以RFP依赖现象为例，拟从体内外同时验证RFP依赖菌株的依赖现象。并通过rpoB基因突变位点分析，比较RFP依赖与耐药菌株的差异，从而探讨依赖菌株的产生原因，为RFP依赖结核病的诊断和防治提供依据。

材料和方法

一、材料

1.菌株：Mtb H37Rv（ATCC27294）为本室保存，46例临床分离菌株均来自国家结核病参比实验室，并在本室保存。

2.实验动物：6～8周龄雄性 SPF（specific pathogen free）级BALB/c小鼠，体质量为16～18 g，购自首都医科大学实验动物中心。经本所动物伦理委员会批准，开展动物实验。

3.试剂和培养基：7H9培养基（美国Difico公司）4.7 g溶于900 ml蒸馏水中，加入2.0 ml甘油，121℃高压10 min，待使用前加入0.1体积分数的营养添加剂白蛋白－葡萄糖－过氧化氢酶（ADC）；7H11培养基（美国Difco公司）21 g，溶于900 ml蒸馏水中，加入5 ml甘油，121℃高压10 min，加入100 ml OADC（oleate－albumin－dextrose－catalase），冷却至50～55℃后分装。含RFP（终浓度为1μg/ml和10μg/ml）的7H11培养基：称取7H11培养基21 g，溶于850 ml蒸馏水中，加入5 ml甘油，121℃高压10 min，加入100 ml OADC，同时加入50 ml 20μg/ml或200μg/ml的无菌 RFP溶液，冷却至50～55℃后分装。RFP，Rfb均购自Sigma公司。

二、方法

1.菌株的耐药情况：46例菌株在改良罗氏培养基上通过绝对浓度法测定其对INH、RFP、EMB、S、Km、卷曲霉素（capreomycin，Cm）、Ofx、左氧氟沙星（levofloxacin，Lfx）（以上药品均购自Sigma公司）的耐药情况。具体操作过程参见《结核病诊断实验室检验规程》［15］。耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）为结核病患者感染的Mtb在体外被证实至少同时对INH和RFP耐药；广泛耐药结核病（extensively drug－resistant tuberculosis，XDR－TB）为结核病患者感染的Mtb在体外被证实除对INH和RFP耐药外，还对任意一种氟喹诺酮类药物及对三种二线抗结核药物注射剂（Km和 Am、Cm）中的至少一种耐药［16］。

2.依赖菌株的筛选：46例菌株以1×104CFU/平皿的菌量分别接种于含0、1和10μg/ml RFP的7H11培养基上，37℃培养，3周后观察菌株在含药培养基上的生长是否较不含药培养基旺盛。根据《结核病诊断实验室检验规程》，菌落生长占接种面积的1/4、1/2、3/4或布满接种面积时，分别记为＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋。菌株在含1μg/ml RFP的培养基上的生长多于在不含药培养基和含10μg/ml RFP的培养基上的生长，且多出＋以上时，判断为低浓度依赖；菌株在含10μg/ml RFP的培养基上的生长多于在不含药培养基和含1μg/ml RFP的培养基上的生长，且多出＋以上时，判断为高浓度依赖；若菌株在含1μg/ml和10μg/ml RFP的培养基上的生长类似，但多于在不含药培养基上的生长，且多出＋以上时，亦判断为高浓度依赖；其余情况，判断为非依赖。

3.小鼠体内实验：选取在体外具有典型的RFP依赖现象的05116菌株，在7 H9液体培养基（含0.05%吐温80）中生长至对数生长期后，用PBS（含0.05%吐温80）制成5×107CFU/ml的菌液。取10 ml置于雾化器中，用气溶胶感染暴露装置感染小鼠。同时取0.1 ml的感染菌液用PBS进行10倍系列稀释后，取0.1 ml接种于7 H11培养基上进行活菌计数。感染2周后开始灌胃给药，每周给药5次，每只小鼠给予0.2 ml。每周记录体质量，并根据体质量调整给药剂量。小鼠按照给药的种类和给药单位剂量分成对照组0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）、10 mg/kg Rfb（Rfb10）组、10 mg/kg RFP（RFP10）组、20 mg/kg RFP（RFP20）组，每组各10只。在感染后第2天、治疗开始时分别解剖3只小鼠，取肺进行活菌计数，作为基线值。在给药后4周、给药后8周，每组各解剖5只小鼠，对肺进行摄影、活菌计数，同时分别接种于不含RFP、含1、10μg/ml RFP的7 H11培养基上，观察菌株的生长情况。

4.检测rpoB基因突变位点：选取利福平依赖与非依赖菌株中MDR及XDR菌株共19株，应用煮沸法提取基因组DNA。挑取少量菌落置于EP（eppendorf）管中，加入100μl TE缓冲液，混匀，煮沸15 min，立即置于冰上5 min，12 000转/min（离心半径8 cm）离心3 min，取上清液，－20℃冰箱保存备用。PCR扩增：上游引物序列5′－TCAGACCACGATGACCGTTCC－3′，下 游 引 物 序 列 5′－GTCCATGTAGTCCACCTCAGACG－3′。PCR 反应采用50μl反应体系：10×PCR缓冲液5μl，MgCl23 μl，d NTPs（10 mmol/L）1 μl，引 物（10μmol/L）各1μl，DNA模板2μl，TaqDNA 多聚酶（5 U/L）1μl，用高压灭菌后的双蒸水补至50μl。94℃预变性5 min，94℃变性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应后，取5μl产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下鉴定有无扩增产物。扩增产物片段长688 bp，送华大基因测序以检测突变位点。

结 果

1.体外筛选RFP依赖的Mtb菌株：本研究从46例RFP耐药的Mtb临床分离株中筛选到18例RFP耐药伴依赖的菌株（39.1%）和28例RFP耐药非依赖的菌株（60.9%）（表1）。18例RFP耐药依赖的菌株中，2例为低浓度依赖菌株，16例高浓度依赖菌株。药敏结果显示，46例菌株具有不同的耐药组合（表1），MDR、XDR分别占14.3%，67.9%；而RFP耐药伴依赖株中，MDR、XDR分别占38.89%，55.56%。

图1 057、05116菌株在体外具有典型的RFP依赖现象：菌株在含10μg/ml RFP的培养基上的生长比在不含药培养基和含1μg/ml RFP的培养基上的生长至少多出＋。1：不含RFP培养基；2：含1μg/ml RFP培养基；3：含10μg/ml RFP培养基

2.体内验证RFP依赖现象：057、05116菌株在体外具有典型的RFP依赖现象（图1）。菌株与含10μg/ml RFP的培养基上的生长比在不含药培养基和含1μg/ml RFP的培养基上的生长至少多出＋。体外药敏实验表明05116菌株为INH低度耐药，RFP高度耐药，对其他所有受试药物均敏感。体外依赖实验表明05116菌株为RFP高浓度依赖。选取05116菌株在小鼠体内验证其RFP依赖现象。给药期间，各组小鼠体质量差异不大（图2）。给药后4周、给药后8周，各组小鼠全肺发生肉芽肿样病理改变（图3，4），但从病理改变和给药后4周的活菌计数结果中未观察到明显的药物依赖现象（表2）。继续给药至8周，各组小鼠的活菌计数结果（lgCFU 为6.20～6.60）接近于最初感染的菌量（lgCFU为5.93），并且各组小鼠的活菌计数结果从高到低依次为：RFP20组、RFP10组、Rfb10组、对照组，说明，RFP及Rfb对小鼠持续给药达8周时，药物对体外RFP依赖的菌株具有一定的促生长作用，并具有浓度依赖性，但差异无统计学意义（与对照组相比，各组P值均大于0.05）。同时，在给药后8周，各组小鼠全肺匀浆液在含1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培养基上的培养结果也显示，菌株仍保持明显的RFP依赖现象（图5）。

表1 RFP耐药株中依赖菌株和非依赖菌株数（株）

表2 给药后各组小鼠肺CFU计数

A列：0μg/mlRFP7H11培养基；B列：1μg/ml7H11培养基；C列：10μg/mlRFP 7H11；在给药后8周，各组小鼠全肺匀浆液在含1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培养基上菌株仍保持明显的RFP依赖现象，对照组菌落较少，而其他组则菌落生长相对旺盛图5 给药后8周，对照组、Rfb10组、RFP10组、RFP20组小鼠肺部活菌在含0μg/ml、1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培养基上的生长情况

3.rpoB基因突变位点：RFP依赖与非依赖菌株中MDR及XDR菌株共19株，对其rpoB基因进行测序，结果显示，8例RFP耐药非依赖的菌株中，rpoB基因526位发生突变的菌株占3/8，531位发生突变的菌株占2/8，533位、522位发生突变以及561位和672位同时发生突变的菌株各占1/8；11例RFP耐药伴依赖的菌株中，rpoB基因526位发生突变的菌株占4/11，531位发生突变的菌株占6/11，511位和518位同时发生突变的菌株占1/11。

讨 论

目前国际尚没有药物依赖菌的判断标准。Mtb依赖菌100%为耐药菌。现有资料显示，在我国耐药结核患者中，RFP依赖菌的检出率为14.13%～17.7%，链霉素依赖菌的检出率为7.8%～11.41%，异烟肼依赖菌的检出率为1.0%～6.52%［4，7］。这说明，在耐药结核患者中，药物依赖菌患者占了很大的比例。本研究中，RFP依赖菌的检出率为39.1%，高于文献报道的值，其原因一方面与样本量有关，另一方面可能与本单位为三级甲等结核病专科医院，接收的多为病情重、耐多药、治疗效果差的重症患者有关。

如图1所示，临床分离菌株在体外具有典型的RFP依赖现象。在本研究中，笔者在小鼠气溶胶感染模型中也观察到给药8周时体外RFP依赖菌株05116对RFP及Rfb的依赖现象：给予RFP及利福类药物治疗依赖性菌株感染的小鼠时，小鼠的肺活菌计数不仅没有降低，反而呈现浓度依赖性增加。同时，将体内传代后的05116菌株重新接种于含不同RFP浓度的7 H11培养基上，菌株仍表现出明显的RFP依赖现象。这些结果间接说明，患者感染药物依赖性Mtb后，继续使用该药不但治疗无效，而且在一定条件下可能促进病原菌生长繁殖，使病情加重。Mtb耐药造成临床用药无效，Mtb药物依赖无疑将导致临床有害用药。这一现象也得到了多位临床医生的观察证实：部分结核患者在用药后，病情恶化；停止用药，病情反而有所缓解。同时，已经有文献报道表明结核患者中存在明显的RFP依赖现象［17］，该患者停用RFP而其他治疗药物不变后，病情明显好转并治愈。RFP依赖菌株05116在小鼠体内也表现出对Rfb的依赖性，这也间接证明Rfb和RFP存在交叉耐药，从而提醒临床医生为RFP耐药的患者选择利福类药物时需慎重考虑。从小鼠给药4周、8周的肺部病理改变中未观察到明显的药物依赖现象，笔者推测其原因之一可能是本研究在气溶胶感染小鼠的过程中，感染菌量偏大，从而无法通过肉眼观察分辨出RFP或Rfb的促生长作用（图3，4）。

有人认为，依赖是在耐药基础上产生的，是量变到质变的过程，可能是耐药菌耐药基因进一步变异的结果［10］。本研究结果表明，RFP依赖株和耐药株在rpoB基因突变位点上略有不同，但因检测的样本量有限，仅检测了19例，不足以说明两者之间是否差异有统计学意义，因此，需要进一步扩大样本量，以鉴定RFP依赖株和耐药株的差异。其他研究也表明，结核分枝杆菌RFP依赖株和耐药株的rpoB基因突变位点基本相同，DNA指纹类型及分布亦无明显特殊性，表明前者的变异主要为表型变异［18］。因此，依赖现象的独特表现可能源于基因表达差异。

综上所述，RFP依赖菌在临床RFP耐药株中的检出率高，并在小鼠体内初步观察到体外RFP依赖菌株的RFP依赖现象。但由于本研究主要以肉眼观察指标来判断药物依赖，没有量化指标，所以研究结果也存在一定的局限性。同时，通过对利福平依赖与非依赖菌株中MDR及XDR菌株进行测序分析，检测突变位点，发现RFP耐药株和依赖株的rpoB基因突变位点基本相同，因此RFP依赖的原因是表型变异还是其他因素尚有待进一步的实验证实。

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