新型先导化合物E体外抗结核分枝杆菌活性的研究

滕丽艳，刘霞，张雪莲，王洪海

1. 复旦大学生命科学学院遗传研究所遗传国家重点实验室，上海 200433; 2. 宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室，银川 750004

结核病已成为危害人类健康的主要杀手之一。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报道，2010年全球共有约2 000万例结核病患者，约880万新发病例 (850万～920万)，110万例死于结核病，另有35万例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者死于结核病[1]。近年来多重耐药结核分枝杆菌菌株的出现又为结核病的防治增加了困难，故研发抗结核分枝杆菌的新型药物迫在眉睫。本实验室前期对容量为5万个小分子化合物的化合物库进行抗结核分枝杆菌活性初步筛选，获得数十个具有抗结核分枝杆菌作用的小分子化合物。本研究对其中一个小分子化合物E的体外抗结核分枝杆菌活性综合评价，为其体内抗结核分枝杆菌活性评价及未来可能临床应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种结核分枝杆菌H37Ra菌株为本实验室保存菌株。

1.1.2试剂Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10培养基为BD公司产品，营养添加剂白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(albumin dextrose catalase，ADC)为BD公司产品，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RIF)均为Sigma公司产品，化合物E为本实验室筛选的新型小分子化合物。

1.1.3器材所用器材包括96孔板、Biotek微孔板分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1化合物E对H37Ra的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度的测定采用96孔板微稀释法测定化合物E对H37Ra的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，以肉眼未见细菌生长的药物浓度为MIC[2]。取生长至对数期的H37Ra，用Middlebrook 7H9-ADC培养基调至OD600=0.1 (0.5 McFarland，即1×107CFU/ml)，稀释100倍，将细菌浓度调整为约1×105CFU/ml。取灭菌96孔圆底微孔板，每孔加200 μl灭菌去离子水以减少检测孔内的培养基蒸发。在第2列孔B～G内，加198 μl上述菌液及2 μl初始浓度为0.25 mg/ml的化合物E或RIF或INH。其余孔内B3～G11加入100 μl菌液。将第2列孔B～G内液体充分混匀后，取100 μl菌液加入到下一个孔内，依此类推。加到G10时，取出100 μl弃掉。G11为不加化合物E的空白对照。同一药物稀释度设3组平行对照。37 ℃恒温箱内培养2周，将肉眼未见细菌生长所需最低浓度确定为化合物E的MIC。从肉眼未见细菌生长孔取培养物100 μl，涂Middlebrook 7H10-ADC平板，置37 ℃恒温箱内继续培养3～4周，以没有细菌生长所对应孔的浓度为化合物E的最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)[3]。各药物终浓度分别为2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 μg/ml。

1.2.2化合物E与INH及RIF协同作用的评价采用棋盘滴定法测定药物之间是否存在协同作用[4]，具体方法如下。根据方法1.2.1测定出的INH、RIF及化合物E对H37Ra的MIC结果，在无菌96孔板中形成如下矩阵:横向1～7为INH或RIF，药物浓度梯度分别为MIC的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6/、1/8、1/10;纵向A～F为化合物E，终浓度分别为MIC的1/2、1/3、1/4、1/5、1/6/、1/8、1/10;每孔接种98 μl 1×105CFU/ml菌液及2种药物各1 μl，即每孔总容量100 μl。以不加药的H37Ra菌液为阴性对照，置37 ℃培养2周。根据联合使用药物后每孔的MIC，计算其分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)及分级抑菌指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)。FIC是联合用药中每种化合物的MIC值，FICI为联合用药中每种化合物MIC值的总和。FICI<0.5为具有正协同作用，FICI>4.0为具有拮抗作用，FICI值为0.5～4.0认为没有协同作用，为相加作用[5]。

1.2.3不同环境条件下化合物E对不同时期H37Ra作用效果的评价

1.2.3.1正常环境潜伏感染是结核分枝杆菌的特点之一，潜伏期结核分枝杆菌处于非生长状态，筛选对潜伏期细菌有效的新型药物是未来抗结核药物研究的目标之一。为评价化合物E对非生长期结核分枝杆菌的抑制活性，采用药物暴露法对不同生长时期结核分枝杆菌进行活性抑制实验[6]。分别取生长10 d、6周的H37Ra菌株，用不含ADC的Middlebrook 7H9培养基调至OD600=0.1，稀释10倍，约1×106CFU/ml。药物稀释法如1.2.1所述。将添加药物的96孔板置于37 ℃恒温箱内培养3 d，分别取出各孔对应样品进行梯度稀释，各取30 μl涂Middlebrook 7H10平板，置37 ℃恒温箱内培养3～4周，以没有加入化合物E的结核分枝杆菌(阴性对照)长出菌落为准。每个样品稀释度重复3次。对不同稀释度样品进行计数。根据菌落计数结果，评价化合物E对不同生长时期结核分枝杆菌的杀菌效果。化合物E终浓度分别为5.00、2.50、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08 μg/ml。

1.2.3.2酸性缺氧环境H37Ra菌株在没有ADC的培养基且缺氧环境中生长处于停滞状态，即持留时期[6]。制备上述1.2.3.1菌液，同时配置2瓶不含ADC与甘油的Middlebrook 7H9液体培养基，分别调节pH值为5.5、7.5。取无菌的0.5 ml Eppendorf管，分别加入pH 5.5培养3周的H37Ra菌液、pH 7.0培养3周的H37Ra菌液、pH 5.5培养2个月的H37Ra菌液、pH 7.0培养2个月的H37Ra菌液各0.5 ml。INH、RIF和化合物E分别加入相应菌液中，调节药物终浓度均为5.00 μg/ml。以不加药物管作为对照。37 ℃恒温箱内孵育3 d，分别取出样品进行不同梯度稀释，取适量涂Middlebrook 7H10平板，置37 ℃恒温箱内培养3～4周，以在这4种培养条件下没有加入任何化合物的结核分枝杆菌(阴性对照)长出菌落为准。每个样品稀释度重复3次。对不同稀释度样品进行计数。根据菌落计数结果，评价在酸性缺氧条件下化合物E对不同生长时期结核分枝杆菌的杀菌效果。

1.2.4结核分枝杆菌对化合物E、INH耐药频率的确定及耐药菌株的分离

结核分枝杆菌尤其是多重耐药和广泛耐药菌株的迅速扩散给结核病控制工作增加了难度。本实验以临床治疗结核病的一线药物INH作为对照，采用实验室体外分离耐药菌株方法，评价结核分枝杆菌对化合物E是否会产生耐药及耐药频率等指标[7]。取生长至对数期的H37Ra，用Middlebrook 7H9-ADC培养基调节细菌浓度为2×108CFU/ml。配制含不同化合物E浓度的Middlebrook 7H10-ADC平板，化合物E浓度分别为4×MIC和8×MIC，同时以4×MIC和8×MIC的INH作对照。取上述菌液200 μl点于平板中，浇以含有上述终浓度化合物的Middlebrook 7H10-ADC培养液。同时，将上述菌液稀释200倍，取10 μl点于平板内，浇以不含任何化合物的Middlebrook 7H10-ADC培养液作为对照。37 ℃恒温箱培养3～4周。计数含有化合物E的Middlebrook 7H10平板菌落数，并以不含化合物E的Middlebrook 7H10平板菌落数作对照，计算耐药频率。挑耐药菌落至Middlebrook 7H9-ADC培养基内，37 ℃恒温箱培养。待耐药菌生长至对数期，根据方法1.2.1检测化合物E对该耐药菌株的MIC，观察MIC是否发生变化，确定是否耐药。同时，将耐药菌株传代培养，传数代后再次检测化合物对该菌株的MIC，观察该耐药菌株是否遗传稳定。重复3次独立实验。

2 结果

2.1 化合物E对H37Ra的MIC、MBC测定

微孔法测定化合物E对H37Ra的MIC，结果为0.078 μg/ml，MBC为0.312 μg/ml, MBC/MIC=4。INH和RIF对H37Ra作用2周的MIC分别为0.039 μg/ml、0.019 μg/ml。

2.2 化合物E与INH及RIF的协同作用评价

化合物E与INH、RIF的体外相互作用结果如下：化合物E与INH联合使用时，联合药物的MIC分别为应用单药MIC的1/2和1/10，与INH的FICI为0.6。当化合物E与RIF联合使用时，联合药物的MIC分别降至应用单药的1/10和1/6，与RIF的FICI为0.27。表明化合物E与INH联合用药有相加作用，与RIF联合用药有协同作用。

2.3 不同环境条件下化合物E对不同时期H37Ra的作用效果

2.3.1正常环境尽管化合物E仅作用于结核分枝杆菌3 d，但对不同时期结核分枝杆菌均表现出明显的抑制作用，且化合物E、INH、RIF对对数期结核分枝杆菌有较明显的抑菌效果(图1～3)。

Compound E (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against the 10-day-old H37Ra than the 6-week-old H37Ra.图1 化合物E对不同时期H37Ra作用的效果Fig.1 The antituberculous effects of compound E against H37Ra at different growing stages in 3-day exposure

Isoniazid (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against 10-day-old H37Ra than the 6-week-old H37Ra as well as compound E.

Compared to compound E and isoniazid, rifampicin (5.00 μg/ml) showed better antituberculous activity against the 6-week-old H37Ra than the 10-day-old H37Ra.

5.00 μg/ml浓度时，化合物E、INH、RIF对生长10 d细菌的抑制效果为细菌数量分别下降(3.22±0.086)lg、(3.27±0.056)lg、(2.69±0.17)lg；而对生长6周、代谢处于稳定状态细菌的抑制效果为细菌数量分别下降(2.57±0.13)lg、(2.48±0.12)lg、(3.23±0.12 lg)。

2.3.2酸性缺氧环境从图4中可看出，在pH=7.0时，5.00 μg/ml化合物E作用于生长3周和2个月的结核分枝杆菌3 d后，与没有加入化合物E相比，菌落计数分别降低2.7 lg、1 lg，显示出良好的杀菌活性。化合物E对生长2个月的结核分枝杆菌的作用虽低于RIF(下降1.7 lg)，但大大强于INH。从图4中还可看出，对生长3周的结核分枝杆菌，pH 7.0更有利，而对生长2个月的结核分枝杆菌，pH 5.5条件下化合物E的杀菌效果更明显。

Compound E (5.00 μg/ml) had activity against both young and old cultures under neutral or acidic conditions. The activities against young culture under neutral condition and old culture under acidic condition were better. Compound E exhibited better activity against old culture than INH but less than RIF (P<0.05).

2.4 结核分枝杆菌对化合物E、INH耐药频率的测定及耐药菌株的分离

经3次独立重复实验后发现，与INH相比，H37Ra菌株对化合物E更不易耐药，而对INH的耐药频率达3.4×10-6。INH对H37Ra耐药菌株的MIC为200 μg/ml。耐药菌株传代培养4代后，INH对H37Ra耐药菌株的MIC仍为200 μg/ml，显示其遗传稳定性。

3 讨论

由于近几年来耐多药和广泛耐药结核病的出现和蔓延，以及HIV感染及其他疾病伴结核分枝杆菌感染患者的增加，使得潜伏结核病患者数量明显增多，全球范围内结核病形势变得更加严峻。开发新型高效的抗结核药物是有效控制结核病策略的主要部分，特别是筛选具有抗耐药结核分枝杆菌及非活跃潜伏结核分枝杆菌活性的药物研究至关重要[8]。

本实验就是从化合物库中筛选具有抗结核分枝杆菌活性的化合物，为后期深入发现抗结核药物提供先导物。从研究结果看，本实验中化合物E具有非常好的抗结核分枝杆菌活性，MIC达0.078 μg/ml，MBC/MIC为4，说明其具有杀菌作用。通过3轮筛选，均没有获得耐化合物E的结核分枝杆菌，而INH的耐药突变率达到3.4×10-6，说明化合物E比INH更不易产生耐药性。

通常，结核分枝杆菌培养2周可达对数期，继续静止培养到4周进入稳定期，6～8周静止培养的结核分枝杆菌处于生长极度缓慢甚至停滞的阶段。但现有治疗结核病的药物多对生长期结核分枝杆菌有效，包括INH。本实验还测定了化合物E在不同环境条件下对不同生长期结核分枝杆菌的抑制活性。如果采用测定MIC的方法进行测定，停滞生长的结核分枝杆菌在转接培养后会继续生长，因此针对生长停滞结核分枝杆菌的药物抑制评价多采用药物暴露方法，即将此时期结核分枝杆菌短时间暴露于药物，通过细菌计数方式评价药物对细菌的抑制作用。从实验结果可看出，在正常条件下，生长活跃及生长停滞的结核分枝杆菌暴露于化合物E后，其生长均受到非常明显的抑制杀伤作用，特别是生长活跃的结核分枝杆菌被抑制的效果更明显，活菌数量显著降低；在酸性缺氧条件下测定化合物E的杀菌活性在一定程度上模拟了体内环境，化合物E亦表现出良好的杀菌活性，特别是对生长2个月的结核分枝杆菌，杀菌作用具有重要意义。在结核病临床治疗中，为提高药效及防止细菌耐药产生，常采用联合用药。当联合用药的2种或3种药物显示有协同或相加作用时，则证明比单独用药更有效[9,10]。从本实验中化合物E与INH和RIF的联合用药结果来看，化合物E没有表现出与一线药物有明显的拮抗作用。化合物E与INH、RIF联用后，MIC均下降，分别表现为相加和协同作用。在对化合物E的后续研究中，可继续检测其在体外与其他一线抗结核药物如乙胺丁醇联用的效果。

在化合物E抗结核分枝杆菌活性评价方面，本文只进行了体外实验，很多研究如其抗耐药结核分枝杆菌的活性、体内抗结核分枝杆菌的活性等还需进一步研究。但化合物E体外良好的抗结核分枝杆菌活性及对生长停滞结核分枝杆菌的抑制活性提示，其可作为未来抗结核药物候选物的先导化合物，值得进一步深入评价。

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