全反式维甲酸对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及海马Aβ蛋白沉积的影响

郭 玫， 翟蕴新， 孟令慧

全反式维甲酸对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及海马Aβ蛋白沉积的影响

郭 玫1， 翟蕴新2， 孟令慧1

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要临床表现为学习记忆障碍，组织病理上可见老年斑、神经元纤维缠结(NFT)和基底前脑胆碱能神经元丢失［1］，其中老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(β－amyloid protein，Aβ)。AD的病因还不是很清楚，很多学者认为Aβ的沉积是AD的始发因素，因此，针对Aβ的治疗措施将成为一种很有潜力的治疗方法。近年来，有研究［2］证明全反式维甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)具有抑制Aβ沉积的作用，本实验通过对AD模型大鼠行为学水平的评价和海马Aβ蛋白沉积的检测，探讨全反式维甲酸对AD模型大鼠学习记忆能力的影响及相应机制。

1 材料和方法

1.1 主要仪器设备 大鼠立体定位仪(日本东京成茂科学器械研究所);水迷宫(北京新天地公司);切片机(德国Leica);光学显微镜(日本Olympus);显微图像分析仪(日本Olympus)。

1.2 主要药品和试剂 Aβ1－40试剂(美国Sigma公司); ATRA(美国Sigma公司);兔抗大鼠Aβ1抗(美国Sigma公司);羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程公司);SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程公司)。

1.3 实验动物分组 220～250g健康雄性SD大鼠(购于中国医大动物部)，于造模前进行水迷宫训练3d，剔除差异明显者，随机分为实验组、AD模型组和对照组，每组6只。实验组:大鼠制成AD模型3d后，按20mg/kg的剂量腹腔注射ATRA，每周3次，连续注射8w。AD模型组:大鼠制成AD模型3d后，腹腔注射等容积溶解液，每周3次，连续注射8w。对照组:大鼠大脑海马区注射5μl生理盐水3d后，再腹腔注射等容积溶解液，每周3次，连续注射8w。

1.4 AD动物模型的制作 首先孵育Aβ1－40，用生理盐水溶解Aβ1－40，配成10μg/μl的溶液。37℃孵育1w，使其变为聚集状态的 Aβ1－40。大鼠经 10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg)后，固定于立体定位仪上，常规备皮消毒，切开头部皮肤，暴露硬脑膜。定位海马CA1区为注射靶区(前囟后3.0mm，中线旁开2.2mm，颅骨表面下2.8mm)，微量进样器自脑表面垂直进针，将Aβ1－401μl缓慢注入，注射速度为5μl/ h，留针10min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针，缝合切口，所有操作均在无菌条件下进行。对照组注入等体积生理盐水。术后动物单笼饲养，3d后进行水迷宫试验，逃避潜伏期明显延长者为造模成功。

1.5 水迷宫试验 参照Morris［3］方法进行。大鼠在造模前训练3d，记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间，此时间称逃避潜伏期，每一时间段内4次潜伏期的算术平均数为这一时段的成绩进行统计分析，根据第3天成绩剔除差异明显者。造模3d后进行水迷宫试验，检测造模是否成功。给药8w后再次行水迷宫试验，检测ATRA对大鼠学习记忆能力的影响。

1.6 免疫组化法检测Aβ蛋白 水迷宫实验后次日即进行Aβ蛋白免疫组化染色。10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室灌注生理盐水，冲净体内血液，然后用4%多聚甲醛液灌流固定，取脑，取材范围为前囟后2.3～3.8mm，置于4%多聚甲醛中后固定24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每隔100μm连续作6μm厚脑冠状面石蜡切片。常规脱蜡至水，3%的去离子水孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡3min，滴加山羊血清室温孵育lh，倾去。滴加1∶600稀释的兔抗大鼠Aβ蛋白一抗，4℃过夜。PBS冲洗3min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用30min。PBS洗3min ×3次，滴加试剂SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次，滴加DAB显色剂，室温显色，镜下控制反应时间。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。每个标本取3张切片，显微图像分析系统采集图像，细胞浆中呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。在400倍高倍镜下，随机观察海马区不重叠的5个视野，计数阳性细胞面积百分比并分别计算其算术平均数。

2 结果

2.1 水迷宫试验结果 造模3d后，AD模型组(25.7± 3.93s)和实验组(27.3±3.91s)逃避潜伏期均较对照组(10.3±2.24s)明显延长(P＜0.05);给药8w后，AD模型组(36.6±5.27s)和实验组(22.4±3.85s)逃避潜伏期均明显长于对照组(8.9±1.96s)(P＜0.05)，实验组逃避潜伏期明显短于AD模型组(P＜0.05)。

2.2 Aβ在脑内沉积情况 对照组海马CA1区神经元排列规则、紧密，形态完整，未见Aβ沉积，AD模型组和实验组海马神经元缺失，可见Aβ沉积;实验组阳性细胞(4.54± 0.68%)显著少于AD模型组(6.98±0.69%)(P＜0.05)。

3 讨论

在阿尔茨海默病(AD)病理机制的研究中，淀粉样蛋白级联反应假说是广为接受的一个学说。该假说基本观点为Aβ的聚集和沉积及其伴随的神经元损害是老年痴呆病理机制的中心环节。Aβ在脑组织沉积会形成老年斑，同时引起tau蛋白高度磷酸化，继而形成神经元纤维缠结。Aβ的沉积还能引起各种免疫炎症反应和神经毒性级联反应，导致以海马和大脑皮质为主的广泛的神经元变性、死亡，出现渐进性的神经递质主要是胆碱能和多巴胺能递质减少，最终导致记忆和认知功能障碍，产生AD症状。

全反式维甲酸(ATRA)是维生素A在体内的活性代谢物，维生素A具有强大的抗氧化和抗细胞变性的作用，而氧化和细胞变性是一系列神经系统变性疾病包括AD的病理基础。研究发现缺乏维生素A会导致大鼠大脑皮质Aβ的聚集［4］和啮齿类动物记忆的下降［5］。空间学习和记忆的下降不仅见于维生素A缺乏的动物，也见于老龄啮齿类动物［6］，给予继甲酸(维生素A酸，retinoic acid，RA)可使症状得到改善。进一步的临床研究发现AD患者脑内存在类维生素A转运和功能的缺陷［7］，提示提高脑内类维生素A的利用可能预防或减少与Aβ相关的神经变性［7，8］。维生素A在细胞质内转化为ATRA［9］，尽管RA具有多种立体异构体，但多以ATRA的形式存在。在试管中［2］，RAα受体信号系统可阻止细胞内外Aβ的沉积，这种作用与金属蛋白10的表达增加有关，金属蛋白10是一种α分泌酶，通过使淀粉前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)进入到无淀粉通路，阻止Aβ形成。ATRA还可在试管中减少新鲜的Aβ向纤维状Aβ转化［10］，减少Aβ沉积。连续8w给予5月龄APP/PS－1转基因小鼠ATRA［11］，发现ATRA可通过下调p35的水平调节Aβ的轴突运输，减少Aβ的沉积，同时ATRA可下调细胞周期依赖性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)的水平，而在既往的研究中［12～14］，CDK在神经元APP的磷酸化过程中起着关键作用。

以上的研究表明ATRA作用于Aβ沉积的多个步骤，减少Aβ的生成，抑制Aβ的聚集和沉积，但鲜少有研究证明ATRA对AD确有治疗效果。本研究利用立体定位海马内注射Aβ建立AD动物模型，通过水迷宫实验检测动物模型学习记忆能力的改变，免疫组化方法检测海马Aβ蛋白沉积，探讨ATRA对AD大鼠学习记忆能力的影响及病理的改变。结果显示ATRA组水迷宫逃避潜伏期较AD模型组明显缩短，同时AD模型组和治疗组海马神经元缺失，周围出现胶质细胞反应，且ATRA组海马Aβ的沉积明显少于AD模型大鼠，表明ATRA可以改善AD动物模型的认知功能，这种治疗作用可能与海马Aβ的沉积减少有关，这与Ding等［11］的研究结果一致。Ding发现ATRA在抑制APP/PS－1转基因小鼠Aβ沉积的同时，还可能通过下调CDK5的水平减少tau蛋白磷酸化，同时显著减少活化的小胶质细胞和星型胶质细胞。ATRA还能够克服由 Aβ肽介导的胆碱乙酰转移酶的下降［15］，使胆碱乙酰转移酶维持在正常水平，以保证胆碱能递质的运转和功能。

目前AD治疗研究的方向都是抑制Aβ产生、促进其降解或加强其从脑内清除。Aβ1－40肽诱导产生的抗Aβ抗体，可以使脑内Aβ沉积显著减少，改善转基因鼠的学习和认知功能［16］，但多中心的临床试验因患者出现脑膜脑炎的副反应而被中止［17］。神经生长因子对损伤神经元具有保护和修复作用，然而由于血脑屏障的紧密连接，常规给药脑内浓度极低。尼莫地平对老年痴呆症和脑血管痉挛有效，但肝首过效应严重，在脑内靶位的含量更低。ATRA作为脂溶性小分子，能够轻易跨越细胞膜屏障，全身给药后在脑组织高度集中［18］，且毒理学性质已确立，若能确定对AD的治疗作用，是一种可行性极高的治疗手段。我们应加大样本量，继续探索ATRA对AD动物模型的作用及机制，为AD的临床治疗提供理论依据。

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1003－2754(2012)06－0549－02

R742

2012－02－29;

2012－05－28

(1.沈阳医学院沈洲医院神经内科，辽宁沈阳110002;2.沈阳市第一医院神经内科，辽宁沈阳110002)