黄连素对125I粒子放疗肝癌的增敏作用与肿瘤血管形成影响的研究

王如华

肝脏是一个辐射敏感器官，其辐射致死剂量为60 Gy/6周，耐受剂量仅为30 Gy，而肝癌必须有超过40 Gy的吸收剂量才能得到较好的局部控制。由于肝脏的放射耐受量低于肝癌组织的放射治疗剂量，故肝癌常规放疗效果不佳。近年来，放射性125I粒子组织间植入治疗肝癌以其简便、易于操作、副作用小等优点广泛应用于临床，但由于植入肿瘤后吸收剂量不均，剂量“冷点”处残存的肿瘤细胞仍可导致复发，植入过多的粒子虽然能避免此缺憾，但同时也对肝脏造成较大损伤［1］。近年来研究发现，黄连素能增加放疗敏感性［2-4］。本研究通过分组实验，论证黄连素可否增强125I粒子的疗效，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及细胞株 雌性 BALB/c裸鼠40只(合格证:SCXK 京2009-0004)，SPF级，6～8周，体重18～20 g，中国医学科学院实验动物研究所提供，于SPF级动物实验室饲养。人肝癌HepG2细胞株(购于北京五洲元业科贸中心)。

1.1.2 仪器与试剂 RM2145切片机(德国Lico公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，游标卡尺(无锡锡工量具有限公司)，粒子植入设备(包括植入枪、穿刺针、撞针均由原子高科股份有限公司提供)，VEGF多克隆抗体、MVD及SP染色试剂(北京中杉公司);RPMI-1640培养基、DMEM培养基(Sigma公司);黄连素(纯度97%，四川省玉鑫药业有限公司);活度 0MBq(0mCi)及活度 29.6MBq(0.8 mCi)的125I粒子(北京智博高科生物技术有限公司产品，批号:2BS0908-13-01)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 将冻存于液氮中的人肝癌HepG2细胞复苏，常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，采取胰酶消化法培养，制成细胞浓度为1×107的单细胞悬液10 mL。于生物安全柜内，用1 mL注射器取200 μL的单细胞悬液，以碘伏溶液消毒裸鼠右腹部皮肤，将细胞悬液接种于BALB/c裸鼠右腹部皮下。1周左右可陆续在接种小鼠的右腋下触及结节，约10 d后成瘤，造模成功 39只，成功率97.5%，平均瘤径 8.14 mm。

1.2.2 实验分组和治疗 将24只瘤径约8 mm的裸鼠随机分为4组，每组6只。治疗前将选取的实验动物拍CT片，将CT图像、125I粒子活度和拟计划剂量输入三维治疗计划系统(TPS)，由TPS确定应植入的125I粒子数量和布阵。生物安全柜内分别取出各组裸鼠，氯胺酮+咪唑安定(1∶1)腹腔注射麻醉后，固定于手术台板上，75%乙醇消毒。根据TPS的要求，在相应位置植入粒子。A组:植入2粒空心粒并每天灌胃适量生理盐水;B组:植入2粒空心粒并按45 mg·kg－1/d灌胃黄连素溶液;C组:植入2粒125I粒子并每天灌胃适量生理盐水，D组:植入2粒125I粒子并按45 mg·kg－1/d灌胃黄连素溶液;植入结束后即刻行CT显像，验证布源与治疗计划一致，然后将小鼠放回鼠笼，注意保暖，防止挤压，待小鼠苏醒后，送返动物房饲养、观察。

1.2.3 观察指标和方法 (1)小鼠存活率:连续观察28 d，记录各组存活鼠数;(2)肿瘤体积变化及其抑制率:对各组小鼠每隔4天用游标卡尺测量1次肿瘤体积大小，用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)及与之垂直的最宽径(b)，利用公式:肿瘤体积(TV)=a×b2/2，计算肿瘤体积，并观察瘤体有无破溃、坏死及粒子脱落，同时根据公式:肿瘤体积抑制率=［(对照组平均体积－治疗组平均体积)/对照组平均体积］×100%，计算肿瘤体积抑制率。

1.2.4 增敏系数(EF)的计算 EF=NGD/AGD，其中NGD(normalized growth delay)为规格化肿瘤生长延缓时间，AGD(absolute growth delay)为绝对肿瘤生长延缓时间;NGD=TD－TB(TD为D组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TB为B组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)。AGD=TC－TA(TC为C组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TA为A组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)。TA、TB、TC、TD的算法为:先将倍增后的体积定位在生长曲线上的相邻两个点之间，求出两点的直线方程，代入倍增后的体积具体数值即可算出。EF＞1提示有放射增敏效应。

1.2.5 石蜡切片制备及VEGF、MVD免疫组化染色新鲜肿瘤标本常规石蜡包埋，每例标本均取相邻组织4 μm厚连续切片，每例取2张切片，分别免疫组化染色。染色步骤参照SP试剂盒产品说明书进行严格操作。显微镜下观察细胞质染色呈棕黄色或棕褐色者为VEGF表达阳性，采用医学图像分析软件IMS细胞图像分析系统进行分析，每张切片随机采样测量3处，计算单位面积下阳性染色区域面积;MVD检测用CD34抗体标志瘤体内微血管，根据CD34染色阳性细胞，计数MVD平均数目。

1.2.6 数理统计 用SPSS 16.0软件进行统计处理，计量资料用表示，两组间比较采用两独立样本t检验，组内不同时间点数据比较采用配对t检验，本研究的检验显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 小鼠存活率

观察28 d，A组小鼠存活4只(66.7%)，B组小鼠存活5只(83.3%)，C、D组小鼠100%存活。小鼠多死于肿瘤转移或腹水造成的恶病质。

2.2 肿瘤体积测量

实验开始后，各组的移植瘤生长速度明显，但是C组、D组在实验第8天后肿瘤体积处于平台期，增长缓慢，而A、B组的裸鼠皮下移植瘤相对肿瘤体积生长较快。经计算所得，各治疗组小鼠肿瘤的平均体积明显小于对照组(P＜0.01)，B、C与D组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，D组肿瘤体积抑制率高于B、C组，具体见表1、图1。

表1 各组治疗前后肿瘤体积变化情况及抑瘤率

表1 各组治疗前后肿瘤体积变化情况及抑瘤率

注:与 A 组比较，＊＊ P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05;与 D 组比较，ΔΔP ＜0.01，ΔP ＜0.05

组别 例数 0 d(mm3) 28 d(mm3) 肿瘤体积抑制率(%)A组4 143.26 ±20.12 1 202.13 ±139.73 －B 组 5 139.38 ±13.87 994.29 ±61.50*ΔΔ 17.310＊＊ΔΔ C 组 6 132.94 ±18.34 391.04 ±19.12＊＊Δ 67.479＊＊Δ D 组 6 134.27 ±17.84 269.10 ±19.26＊＊ 77.619＊＊

图1 各组裸鼠治疗后肿瘤生长情况

2.3 增敏系数(EF)

D组的生长延缓时间最长，EF=1.84＞1，提示黄连素对125I粒子的放疗有增敏作用，具体见表2。

表2 增敏系数计算表

2.4 各组肿瘤组织中VEGF及微血管密度(MVD)免疫组化表达

根据医学图像分析软件IMS细胞图像分析系统分析。与A组比较，B组虽能下调VEGF的表达，但是差异无统计学意义(P＞0.05)，而C组能显著下调VEGF表达(P＜0.01)，且D组下调更明显，与C组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示黄连素能够增强125I粒子下调VEGF表达的能力。各治疗组的MVD数显著低于A组(P＜0.05)，而D组的MVD数相对比B、C组更低，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明黄连素联合125I粒子组中的MVD的表达最少，其结果见表3。

表3 各组荷瘤鼠肿瘤组织中VEGF及MVD的表达

表3 各组荷瘤鼠肿瘤组织中VEGF及MVD的表达

注:与 A 组比较，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05;与 D 组比较，ΔΔP ＜0.01，ΔP ＜0.05。

组别 例数 VEGF表达量(×107)MVD A组43.31 ±0.77 23.91 ±2.28 B 组 5 2.96 ±0.34ΔΔ 18.60 ±1.56*ΔΔ C 组 6 2.13 ±0.51＊＊Δ 11.07 ±1.74＊＊Δ D 组 6 1.74 ±0.21＊＊ 7.19 ±1.32＊＊

3 讨论

实体瘤的生长和转移依赖于肿瘤新生血管生成［5］。当肿瘤体积达到1～2 mm3时需要依靠新生血管来获取营养及氧以维持肿瘤的迅速生长，否则肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。早在20世纪70年代，Folkman等依据大量的实验证据，提出肿瘤的生长及转移依赖于新生血管形成。VEGF是目前发现的活性和专属性最强的血管生成因子［6］，广泛表达于肿瘤细胞，在肿瘤血管形成机制方面发挥至关重要的作用，与肝癌的形成、发展、预后密切相关［7-9］，所以我们选择了VEGF做为研究的主要目标，MVD为评价肿瘤组织新生血管的客观指标。本实验中分别观察了黄连素、125I粒子、125I粒子联合黄连素对荷人肝癌移植瘤的治疗作用，结果提示，治疗组均能降低VEGF表达和肿瘤MVD，从而抑制肿瘤细胞的生长，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而且以125I粒子联合黄连素组抑制效果最佳，与黄连素组和125I粒子组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。另在本研究的预试验中，我们先对不同剂量黄连素的 EF进行考察，发现30 mg·kg－1/d、45 mg·kg－1/d 和60 mg·kg－1/d 3 个剂量的 EF 分别为 0.89、1.84、1.91，证明黄连素剂量为30 mg·kg－1/d(EF ＜1)时无增敏作用，而 45 mg·kg－1/d和60 mg·kg－1/d的 EF 相差不大，考虑到大剂量的黄连素可能存在的不良反应，故将研究剂量定为 45 mg·kg－1/d。

实体瘤的发生发展依赖于一定的条件。首先，肿瘤性脉管系统的结构和功能异常能使瘤组织血液灌流不畅而致氧供不足及代谢障碍，低氧可在多方面影响肿瘤的发展，如促进肿瘤的侵袭和转移、使肿瘤对放疗不敏感等。现代药理研究表明，黄连素具有抗血小板聚集作用，这一特性将会改善肿瘤微环境的血流供应情况，减少对射线抗拒的乏氧细胞，从而增加肿瘤对放射线的杀伤敏感性。此外，近年来的研究发现黄连素通过诱导激活细胞凋亡诱导途径中一个非常重要的蛋白酶Caspase-3及抑制肿瘤发生过程中的一个重要转录因子AP-1，而对人肝癌细胞产生抑制作用［4］。同时，黄连素不但能与DNA结合导致DNA形态发生变化，还对RNA和蛋白质的生物合成具有更强的抑制作用。其结果使得DNA链变得比较“脆弱”，进而提高了放射敏感性;另一方面黄连素还对潜在致死损伤修复有较强的抑制作用，从而改变辐射损伤，起到放射增敏作用。

本实验研究发现，黄连素可以增强125I粒子近距离持续放射作用，通过下调肿瘤组织中VEGF的表达来抑制肿瘤新生血管的生成，从而起到增敏作用。黄连素是否还能通过其他途径增加125I粒子放疗效果，还有待进一步研究。

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