SNP及其在鱼类养殖中的应用

邹刚刚，陈永久，吴常文

（浙江海洋学院海洋科学学院，国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316004）

分子标记的广泛应用促进了动物遗传学和进化生物学的发展。在一系列的分子标记当中，由于操作方便，信息量多等原因，微卫星DNA分子标记近年来被广泛使用。尽管如此，一种新的分子标记，SNP（single nucleotide polymorphisms），即单核苷酸多态性，它的出现却吸引了研究者的目光，受到了更多人的欢迎[1]。

SNP是指单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列的多态性，最早在1996年由LANDER[2]提出来的。SNP所表现出的多态性是由于单个碱基发生转换、颠换、插入或缺失所导致的。由于CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基容易自发脱氨形成胸腺嘧啶，所以转换发生的频率最高，约占全部变异的2/3，而且三或四等位的SNP几乎没有，因此通常我们所说的SNP为二等位多态性[3]。

在染色体中，DNA的突变是随机的，任何的碱基都有可能发生突变。SNP在基因组中分为两类，一类发生在编码区当中，又叫cSNP，另一类发生在非编码区当中。HALUSHKA等[4]根据对75个基因的检测推测人类基因组的SNP位点大概有100万个，其中一半以上存在于非编码区，1/5-2/5存在于编码区当中。非编码区的SNP对于蛋白质的合成没有直接的影响，但可能在种群遗传进化及其相关方面有作用[5]。而编码区的SNP可能对生物后代的遗传性状产生一定的影响，据此又可分为同义SNP和非同义SNP。同义SNP对蛋白质的合成没有什么影响，而非同义SNP会改变蛋白质的意义。研究表明20%左右的非同义cSNP会导致合成蛋白质意义发生变化[6]，这种变化可能直接导致生物性状发生改变。由于单核苷酸的差别，导致了个体间的差异。对这些差异的研究有助于了解不同种群的个体生长状态，对疾病的抵抗能力，以及对环境的适应能力，进而应用到水产养殖实践中，具有非常重要的意义。

1 SNP的检测

到目前为止，传统检测SNP的的技术和方法已有很多种，例如DNA测序、RFLP、AFLP等。随着技术的进步，各种新型的检测SNP的技术也在不断的出现，如，RRS、质谱分析、DHPLC等。每种方法都有其不同的特点，以下简要介绍几个比较典型的检测方法。

1.1 DNA sequencing

DNA sequencing即DNA测序是检测SNP最直接的方法。最早的测序方法是SANGER和COULSON发明的“加减法”[7]。主要原理是对不同个体的相同基因片段进行测序，最后进行比对和分析，利用该方法检测SNP位点。1977年SANGER等[8]提出了双脱氧链终止法进行DNA测序。SANGER的方法精确度高，但费用昂贵。目前最新的DNA测序技术正朝向高效率、低成本的方向发展。2009年PUSHKAREV等[9]利用Heli scope单分子测序仪[10]用了4个星期对1名白人男子的基因组进行测序，测序范围覆盖了90%的人类参考基因组，鉴定出了280万个SNP位点。

1.2 MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS，即基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱分析法。基本原理是将待测样本与一定量的基质化合物混合，利用基质吸收激光的能量，将能量传递给待测样本，使得待测样本离子化，该过程不会引起待测样本断裂，离子化的样本在质谱仪中加速、检测，最后根据样本的质量比进行分型。PARACCHINI等[11]利用MALDI-TOF MS技术对人类的Y染色体进行SNP的分型，精确度100%。目前该方法主要用于已知SNP的分析，对于未知SNP的分析还处于探索阶段，不过KREBS等[12]利用MALDI建立了一种寻找新的SNP的方法，具有高通量，速度快等优点。

1.3 DHPLC

目前，变性高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）的技术也应用SNP位点的检测中。基本原理是将待测样品与对照DNA混合，加热使其变性，然后退火，利用DNA带负电荷的性质，将重新合成的DNA混合物吸附在固定相上，若重新合成的DNA混合物中存在变异位点，根据Tm值的不同，具有变异位点的杂合双链比同源双链更容易被洗脱下来，从而进行分离。DHPLC技术是由OEFNER等[13]在1995建立起来的，具有敏感性和特异性高，自动化程度强等优点，但其检测结果受PCR产物、洗脱温度、固定相和流动相等因素的影响。

1.4 RFLP

RFLP技术（Restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性），DNA限制性内切酶能够对DNA的特定位点进行酶切，如果该酶切位点发生碱基的替换，则内切酶则不能对该酶切位点进行酶切，或者其它的某个位点发生变化，导致产生该酶切位点，这都会导致最后酶切片段的数目和大小发生变化，从而呈现出DNA多态的现象。SNP导致限制酶切位点的产生或消除，然后可以通过相应的酶切和电泳加以检测SNP的存在。该方法简便，快速，但是只适合少量SNP的检测[14]。

1.5 SSCP

单链构象多态性(SSCP，Single-strand conformational polymorphism），对待测DNA片段进行变性处理，然后在非变性的条件下进行电泳，变性后的DNA单链由于碱基间的相互作用或形成一定比较稳定的折叠结构。如果存在SNP位点，形成的折叠结构的构象则会有所不同。通过电泳时不同构象的DNA电泳迁移率不同检测SNP，检测效率在70%～90%以上[15]。HE等[16]利用SSCP方法对牙鲆的细胞色素P450-c19a基因进行SNP检测分析，找到了3个SNP位点。

1.6 RRS

约化表示散弹枪式排序法（Reduced representation shotgun sequencing,RRS）是美国ALTSHULER等[17]于2000年提出的。RRS方法可用于未知SNP的分析，利用该方法，ALTSHULER等检测出人类基因组中47 172个SNP位点。随后OLSEN等[18]对环斑海豹Phoca hispida进行了种群遗传学方面的研究，发现了768个SNP位点。RRS技术具有检测速度快、便宜等优点，可用于水产业和农业中的重要物种的SNP遗传图谱的构建。

1.7 基因芯片

基因芯片，又称DNA微阵列也是利用DNA杂交的原理建立起来的。基本原理是通过将大量特异的寡核苷酸序列探针固定在支持物上，然后与待测样本进行杂交，通过检测、分析杂交信号，获得SNP位点相关信息。BURTON等[19]利用基因芯片，对患者与健康者进行SNP分析，发现在4种疾病中两者的基因组存在一定的SNP位点差异，对于这些疾病的治疗具有一定的应用意义。MOHAMMAD等[20]利用SNP芯片，对膀胱癌患者进行了SNP全基因组分析，具有一定的应用价值。基因芯片技术具有高度集成化、自动化、信息量大，但是费用高。目前在水产养殖方面应用很少，还需要不断对其不断改进。

2 SNP与微卫星标记技术的对比

目前，分子标记作为动物遗传学当中不可或缺的一部分，它们的出现主要是靠不断发展的分子生物技术。研究者根据自身研究需求不同，而采用不同的分子标记技术。SNP作为一种最新的分子标记技术，出现在微卫星之后，有必要对它们进行一定的比较和总结，从而为研究者从事科学研究时提供一定的参考。

微卫星主要是指在基因组序列中具有一定的简单的串联的重复序列，因此又称短串联重复序列或简单重复序列，一般小于10 bp。微卫星最早发现可以追溯至上个世纪70年代SKINNER等[21]的研究中，1992年GOOF等[22]对斑马鱼Brachydanio rerio基因组中的简单重复序列进行了研究。由于微卫星技术具有多态性高、可自动检测、数量多等特点，因此广泛被应用于个体识别、亲本鉴定、基因组作图、物种的遗传多样性研究等领域当中。

SNP标记技术继微卫星技术之后出现的新一代分子标记具有更多的优点，主要在以下几个方面。首先，SNP是单个核苷酸发生改变，突变率小，相对于微卫星片段遗传稳定性更高[23]。其次，SNP数目多，大约1 000 bp左右就会有1个SNP突变位点，而每15 kb才会有一个微卫星位点[24]，因此更有利于复杂遗传性状的分析，例如物种迁移，亲本鉴定[25]等。还有，在检测时，微卫星标记需要进行片段长度的检测，而SNP基本上为二等位基因变异，只需要进行简单的“+/-”或“有/无”的分析，因此SNP更便于高通量的检测和分析[26]。

然而，SNP大多数是二等位基因型变异，多态性比微卫星标记低。另外，对于一些单个位点的检测，例如离群值的选择位点检测，多等位的微卫星标记则比SNP标记有明显的优势[27]。另外在个体鉴定当中，单个SNP标记鉴定效果比多等位基因标记小2～4倍，但对于小于60～80 bp的PCR产物的单管重复检测中，SNP将会提供更有效的检测效果[28]。虽然SNP标记存在一定的缺陷，但由于其遗传稳定性比其它标记高，而且具有高通量、高密度和便于自动化分析等优点，所以SNP被认为是微卫星分子标记技术之后的分子标记技术的发展方向[29]。

3 SNP在鱼类养殖方面的应用

3.1 遗传图谱的构建

遗传图谱指是基因或分子标记在染色体上呈线性排列。遗传图谱可以对一些重要经济性状和QTL进行定位,最终为实际应用打下基础。另外构建高密度的遗传图谱可以推动标记辅助选育和分子育种的发展，以及相关物理图谱的构建。

目前，应用比较广泛的是利用微卫星分子标记构建第二代遗传图谱，已经在斑马鱼[30]、罗非鱼Oreochromis spp.[31]和虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss[32]上进行了一定的研究，但仍然不是理想的基因作图的手段。微卫星技术的主要缺陷就是检测手段的自动化程度不高，对于超过10个位点的单个反应的检测有困难。而且微卫星标记在基因组中的数量不多，寻找这些标记比较耗时，尤其是高通量的位点需要分析的时候[33]。另外微卫星标记不适于关联性分析，原因在于不同的物种可能出现片段大小相等的微卫星等位标记，也有可能在相同的物种中出现片段大小不同的微卫星标记，造成分析的困难[34]。因此需要发展新一代的基因图谱。

做为第三代分子标记，SNP具有数目多，遗传稳定性高和易于检测等优点。虽然SNP相对于微卫星的变异更少，并且需要更多的位点信息来构建遗传图谱。然而SLATE[35]进行的模拟研究表明，在典型家系的野生群体当中，SNP在基因位点距离在2 cm或间隔更大的情况下，SNP构建的遗传连锁图谱精度和准确率更高。目前SNP遗传图谱主要应用于一些模式生物。WANG等[36]第一次构建了人类SNP遗传图谱；CHO等[37]对拟南芥Arabidopsis thaliana进行了SNP遗传图谱的构建；PETKOV等[38]对小鼠的SNP遗传图谱的进行了研究。水产养殖方面，STICKNEY等[39]利用SNP和寡核苷酸微阵列技术对斑马鱼的基因组进行了分析，获得了第一个斑马鱼的SNP遗传图谱。此外，利用SNP分子标记技术可将物理图谱与遗传图谱进行一定的结合[40]。

3.2 在进化生物学和生态学中的研究

自然界中物种的进化以及种群的多样性直接与基因组DNA的突变相关，而在水产养殖当中，种质资源的好坏直接关系到了水产养殖业的发展，因此亟需对养殖物种的种质资源进行合理的利用和保护。近年来随着SNP技术的广泛发展，研究者们意识到SNP能够解决很多物种在进化生物学和生态学当中棘手的问题[41-43]。近年来，这方面的研究为种质资源的利用和保护提供了一定的应用基础。相对于其他分子标记技术，SNP分子标记能够提供更好的数据分析结果[44]，在遗传多样性以及相关物种进化研究方面有着十分重要的作用。

3.3 个体识别和亲缘关系鉴定

长期的自然和人工选择，物种的基因型发生了一定改变，从而形成了不同的种群结构。对于类似群体的研究，有利于了解群体的分布，这对于养殖具有重要的意义。传统的分类手段主要依靠其表形特征，困难大，准确性不高。而表形特征主要是遗传物质后期表达出的结果，利用分子标记技术可以计算不同物种的遗传距离以及相似度。KARLSSON等[45]对大西洋鲑鱼Salmo salar的7 000个SNP位点进行筛选，结果发现60个位点可用于野生和养殖群体的鉴别；SMITH等[46]通过10个SNP位点区分了两个不同流域的大鳞大麻哈鱼Oncorhynchus tshawytscha；通过SNP和微卫星标记对养殖和野生的大西洋鲑进行研究，RENGMARK等[47]发现可以利用这些标记对养殖和野生的群体进行分离鉴定。

3.4 遗传多样性和种质资源保护

遗传多样性是衡量一个种群种质资源质量的重要标准，遗传多样性的降低会影响群体的生存和适应能力，从而导致种质的衰退，影响了养殖业的发展。另外人为破坏自然环境，过度捕捞，也会导致了一些群体的种质资源和遗传多样性的破坏，一些优良性状消失，不利性状产生。通过分子标记技术对野生和养殖群体进行相关研究，有利于种质资源的保护以及水产养殖业的持续发展。CREELMAN等[48]通过对19个群体中的2 013个大西洋鲑鱼个体中的45个SNP位点进行了遗传结构的分析，说明了不同种的遗传结构的不同主要是由于地理和时间差异造成的，这为资源保护、商业管理和自然渔业的发展提供一定的应用基础；CARVALHO小组[49]先后对鳕、舌鳎和大西洋鲱Clupea harengus三种经济鱼种进行了SNP分析，制造了一种SNP芯片，利用该芯片能够有效确定渔获物的来源地，可用于打击非法捕捞。

3.5 分子遗传育种中的应用

目前随着鱼类养殖业的发展，需要对一些养殖物种进行一定的遗传性状改良和良种的选育。传统方法有耗时长和效果差等缺点，而以分子标记为基础的分子育种技术可以在短时间内对遗传性状进行改良以及进行良种选育。GOMEZ-RAYA等[50]认为相对于传统育种，分子辅助育种的使用可提高育种速度约11%。SNP标记的发展能够对物种关联性状和相关遗传特点进行更准确和快速地研究，有利于促进养殖群体遗传性状改良与良种筛选的发展。在一项对北极嘉鱼Salvelinus alpinus L.的基因与生长速率相互关系的研究中，TAO等[51]发现了1个与嘉鱼早期生长有联系的SNP位点。MC4R基因能够产生一种黑皮素受体-4，是一种肽类物质，对动物的能量代谢和质量有着重要的的作用[52]；刘福平等[53]在罗非鱼MC4R基因的研究中发现了5个SNP位点。由于这些位点在体质量和体长方面具有一定的显著性差异，因此猜测可以应用于罗非鱼的分子标记辅助育种；张晓峰等[54]利用31个EST序列检测69个与鲤鱼Cyprinus carpio生长相关的SNP位点，促进了关于鲤鱼生长性状的分子研究，可用于鲤鱼的分子育种。MOEN等[55]通过对17 056个EST序列分析后，检测出724个SNP位点，而且大多数的SNP位点显示出很少的分化，他们认为这些SNP分子标记可以作为一种非常有力的工具应用于水产养殖业。

4 问题与展望

虽然SNP已经有了一定长足的发展，但目前仍然存在着一些问题。首先，由于SNP属于一种新兴的分子标记技术，在人类等模式生物中已经有了很多的应用，但是在鱼类水产养殖当中研究还比较少，没有足够的SNP位点信息用于相关的研究，因此发展较慢。另外使用SNP进行关联分析仍然存在很多障碍，疾病的突变率以及相关的分子标记的突变率，分子标记的适用性，等位基因的重组等因素都影响了SNP分子标记的效果[56]，因此需要筛选更适宜的SNP标记位点。还有现在很多公司都在纷纷进行SNP的专利申请，加剧了研究者相互的竞争，不利于信息的交流。最后，目前的SNP标记需要较大资金上的投入，设备仪器价格昂贵，对SNP标记更多的研究局限于一些大型的实验室。

总的来说，SNP的发展潮流很好。各种高效的SNP检测技术的发展以及相关材料研制成功都会加速SNP的发展。近年来，SNP在相关鱼类养殖的研究中已经有了进步，取得了良好的效果。通过SNP标记技术可以对养殖群体资源进行合理的评估、鉴定、保护和利用，最终将推动水产养殖业可持续的发展。

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