外源性PCr对小鼠全脑缺血性损伤的保护作用

范维伟，孙慧君，蔡超俊，袁 玮，韩国柱

(大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044)

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人体内自有的活性物质，具有维持细胞高能磷酸水平、稳定磷脂膜、保护机体免受自由基过氧化损害等作用。目前，PCr已能人工合成并作为一种高效低毒的心肌保护药, 为英国马丁代尔大药典[1]收载。虽然临床已有将外源性磷酸肌酸作为脑损伤保护的药物应用,但尚未获得相关部门正式批准，基础研究报道亦较少见。本文采用动物永久性脑缺血及脑缺血再灌注损伤模型观察外源性PCr对缺血性脑损伤的保护作用,以期为临床应用提供相关实验及理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性昆明种小鼠(体重20～24 g)，大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2008-0002。

1.2 药品及试剂

磷酸肌酸钠注射用粉针剂：哈尔滨博莱制药有限公司惠赠 070823；尼莫地平粉剂：天津中央制药厂 (20100611)；蛋白、MDA、SOD测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，20090421；CD14(多克隆)抗体及通用型二抗、DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，20100801；Western Blot试剂及IP细胞裂解液：碧云天生物技术研究所；Super ECL Plus超敏发光液：普利莱基因技术有限公司；余均为市售分析纯。

1.3 主要仪器

CF16RX高速冷冻离心机：HITACHI,日本；水平电泳仪：大连捷迈科贸有限公司；Biospectrum AC Chemi HR 410凝胶成像系统：Biospeetrum，美国；754型分光光度计：尤尼可上海仪器有限公司。

1.4 外源性PCr对小鼠全脑永久性缺血损伤的影响

1.4.1 动物分组、给药及模型制备：小鼠60只，随机分为对照组、PCr高剂量组(4.5 g·kg-1)、PCr 低剂量组(1.5 g·kg-1)，每组20只。腹腔注射给药，容量0.1 mL·10 g-1体重，对照组给予等容量NS。于给药20 min后用大组织剪沿小鼠双耳连线下部快速断头，制备全脑永久性缺血模型。

1.4.2 标本处理及指标测定：每组取10只于断头即刻记录张口喘息持续时间。另10只于动物断头20 s取大脑，一侧半球制备10%脑组织匀浆，严格按照试剂盒说明书测定蛋白浓度(考马斯亮蓝法)、SOD活力(黄嘌呤氧化酶法)及MDA含量(TBA法)。另侧脑半球经10%福尔马林固定，常规制备石蜡片HE染色。

1.5 外源性PCr对小鼠全脑缺血再灌注(global brain ischemia /reperfusion GBI/R)损伤的影响

1.5.1 实验分组、给药及模型制备：小鼠50只，随机分为假手术组、模型组、PCr高剂量组(2.0 g·kg-1)、低剂量组(1.0 g·kg-1)组及尼莫地平(Nim)组，每组10只。NS及PGr分别以0.1 mL·10 g-1体重于首次缺血即刻1次尾静脉注射，Nim组术前2 d 始灌胃给药，2次/d，每次100 mg·kg-1体重，手术当天术前30 min末次给药。

按文献[2]方法，小鼠麻醉，双侧颈总动脉(CCA)完全阻断血流10 min，复灌10 min，重复3次，制备全脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅暴露CCA，不进行缺血再灌操作。不同处理组小鼠分别于末次再灌2 h后断头取脑。

1.5.2 标本处理及指标测定：每组取10只小鼠左侧大脑测定脑组织含水量(干湿重法)

脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100

Western Blot法测定CD14蛋白表达：每组取6只小鼠右侧大脑组织经裂解液充分裂解后，4℃离心取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。12%SDS-PAGE分离胶，5%SDS-PAGE浓缩胶。样品经处理后上样，电泳、PVDF膜转膜(恒流0.8 mA/cm，室温，48 min)，5%脱脂奶粉封闭。Rabbit anti-Rat CD14(1∶250)以及β-Actin抗体(1∶1000)孵育过夜(4℃)，二抗(1∶5000) 37℃水浴孵育2 h。ECL暗室显色，凝胶成像系统拍照后Gel-ProAnalyzer 4.0软件分析。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 外源性PCr对小鼠全脑永久性缺血损伤的影响

高剂量PCr可延长小鼠永久性全脑缺血后张口喘息持续时间、增加脑组织中SOD活力，与对照组比较P<0.05。高、低剂量组小鼠脑组织中MDA含量均明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

Tab 1 The effects of exogenous PCr on gasping time and level of SOD、MDA in brain tissues after permanence ischemia

组别张口喘息时间(s)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)对照组21.4±2.98.04±3.0437.52±3.82PCr低剂量组20.3±2.15.09±3.481)37.43±4.00PCr高剂量组27.1±3.61)3.46±1.291)44.26±5.291)

1)与对照组比较,P<0.05

2.2 外源性PCr对小鼠GBI/R损伤的影响

2.2.1 外源性PCr对脑含水量的影响：与假手术组比较，GBI/R模型组脑含水量升高明显 (P<0.05)；给予外源性PCr及Nim处理后脑含水量低于模型组，差异具有显著性意义(P<0.05)，见表2。

2.2.2 外源性PCr对脑组织中CD14蛋白表达的影响：Western Blot法检测显示小鼠GBI/R后脑组织CD14蛋白表达明显升高。不同剂量PCr处理可明显降低CD14升高的程度。见表2，图1。

表2外源性PCr对小鼠GBI/RF损伤后脑含水量及CD14表达的影响

Tab 2 The effects of exogenous PCr on Brain water content and expression of CD14 in brain tissue after GBI/R in mice

CD14=OD(CD14)/OD(β-Actin)；1)与假手术组比较，P<0.01； 2)与模型组比较，P<0.05

图1外源性PCr对小鼠脑组织中CD14蛋白表达的影响

Fig 1 The effects of exogenous PCr on expression of CD14 in brain tissue after GBI/R in mice

1.模型组；2.假手术组；3.PCr低剂量组；4.PCr高剂量组；5.Nim组

2.2.3 对脑组织病理变化的影响：经组织切片HE染色镜下观察，结果显示假手术组神经细胞大小、形态结构完整，核大而圆无固缩，间质均匀致密；模型组可见大量神经细胞变性，胞核固缩、深染, 细胞周围间隙结构松散，出现大量空泡， PCr及Nim给药组与模型组相比病变程度均明显减轻。见图2。

3 讨 论

急性脑缺血是临床上常见的脑血管疾病之一，能量代谢障碍是导致细胞损伤的触发因素，有效提供能量是缺血早期治疗，减轻组织损伤的关键。本研究所用小鼠脑缺血性损伤模型具有良好的重现性，损伤指标明确。

磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是体内高能磷酸化合物的储存形式，其分子中含高能量的氨基磷酸键，在细胞中水解可产生超过12000 kal/mol能量，是细胞的重要能源物质[3]。在组织大量消耗ATP，导致ADP增多时，PCr可将其磷酸键转移给ADP生成ATP以补充能量的供应，在生理及应激条件下通过此反应维持机体能量代谢的动态平衡[4-5]同时具有稳定磷脂膜、保护细胞免受自由基过氧化损害等作用[6]。近期有研究认为,PCr的作用方式可能有以下两方面:(1)通过PCr分子起作用,其含有的高能磷酸键参与能量代谢,使ATP生成增加；(2)通过其体内代谢产物肌酸(creatine，Cr)发挥作用,在这种情况下,PCr作为Cr的一个前体药物或载体而发挥作用[7]。

脑缺血时可产生大量氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用，引起细胞损伤。此过程生成的MDA等脂质过氧化物的分解产物亦可造成细胞损伤。SOD清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤。将MDA与SOD配合测定，以反映机体氧化损伤和抗氧化能力是本类研究常用方法。

图2外源性PCr对小鼠GBI/R脑组织病理形态学的影响(HE染色)
Fig 2 The effects of exogenous PCr on pathomorphology changes in brain tissue after GBI/R in mice (H&E Staining)
1. 模型组； 2. 假手术组； 3.PCr低剂量组； 4.PCr高剂量组； 5.Nim组

诸多研究已证实，急性脑缺血时因中枢神经功能障碍导致植物神经功能紊乱，加之机体发生应激反应导致肠黏膜屏障功能受损，细菌移位、大量内毒素释放并诱导细胞表面受体(CD14)表达增多，参与并加重组织损伤，甚至触发多器官功能障碍综合征的发生。

本研究结果显示外源性PCr可明显延长全脑永久性缺血后张口呼吸时间；减轻脑水肿及损伤后脑组织形态学改变。显示外源性PCr可有效缓解脑缺血性损伤，维持脑功能。而降低组织MDA含量、提高SOD活力；抑制损伤后CD14表达则提示PCr抗脑缺血性损伤作用可能通过增加供能、稳定细胞内腺苷酸池，稳定磷脂膜等机制，进而提高组织抗氧化性损伤能力及降低继发性内毒素攻击、保护细胞有关。

本研究在一定程度上证实了在脑缺血早期给予外源性PCr可有效减轻脑组织缺血及缺血再灌注损伤，维持脑功能，并有可能减轻脑损伤继发的其他组织器官损伤。为临床用药提供了实验和理论依据。

[1] The Royal Pharmaceutical Society. Martindale:The Extra Pharmacopoeia[M]. 31st ed. London: Pharmaceutical Press,1996.1695.

[2] Du GH, Qiu Y, Zhang JT. Salvianolic acid B protects the memory functions against transient cerebral ischemia in mice[J]. JNA PR, 2000, 2(2) :145-152.

[3] 秦厉杰.外源性磷酸肌酸治疗急性脑梗死的疗效观察[J].中国实用神经疾病杂志,2007,10(3)： 31-32.

[4] Jiang YF，Pan YS，Huang QF，et al.The effect of herbs on cerebral energy metabolism in cerebral ischemia-reperfusion mice[J].Chin Med J，2001，114(8)：881-883.

[5] 张颖，蒋玉凤，刘智勤，等.丹酚酸B对小鼠脑缺血不同时间脑能量代谢及脑水肿的作用[J].药学学报，2007，42(12)：1250-1253.

[6] 王汝卫.磷酸肌酸的药理与临床应用[J].首都医药，1999，6(5)：32.

[7] 邹玲莉,李秋莎,韩国柱,等.外源性磷酸肌酸在大鼠体内的药代动力学和代谢处置[J].药学学报, 2011,46(1):75-80.