亚低温对大鼠短暂性全脑缺血后APE/Ref-1表达、神经元凋亡的影响

汪效松，雷惠新，张 旭，李智文，张志坚

( 1.福建医科大学 省立临床医学院 福建省立医院 神经内科，福建 福州 350001；2.福建省神经病学研究所，福建 福州 350005)

缺血/再灌注后神经元存在着由ROS(活性氧)引起的氧化性DNA损伤，可继发凋亡[1]。APE/Ref-1 蛋白是一种多功能蛋白，其内所含的AP核酸内切酶是ROS氧化性DNA损伤修复过程中的限速酶，具有碱基切除修复功能，可针对此损伤过程进行基因修复；此外，它又参与氧化还原反应调控多种转录因子(AP-1、核因子κB等)的DNA结合活性，发挥转录因子的作用[2]。亚低温是目前存在的对试验性脑缺血损害最有效的治疗方法[3-4],但其机理仍有许多不明之处。本研究旨在建立大鼠短暂性全脑缺血模型,观察亚低温对缺血敏感的海马区神经元凋亡及APE/Ref-1蛋白表达的影响,试对亚低温的脑保护机理作进一步探索。

1 材料和方法

1.1 实验对象及分组

健康清洁级雄性SD大鼠56只(由上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供)，体重300～350 g，随机分为3组: (1)假手术组8只；(2)常温缺血组：分缺血10 min后常温下存活1、2、3 d 3组，每组8只，共24只；(3)亚低温缺血组：分缺血10 min后亚低温3 h,存活1、2、3 d 3组。每组8只，共24只。

1.2 仪 器

动物解剖学显微镜(型号SZ40，Olympus公司)；光学显微镜(型号CH20-BIM，Olympus公司)；BL-310生物机能实验系统(成都泰盟电子有限公司)。

1.3 试 剂

原位细胞凋亡检测试剂盒(德国宝灵曼公司)；APE/Ref-1抗体(北京中山生物技术有限公司)；SP试剂盒(福州迈新生物工程公司提供)。

1.4 温度控制

采用Maier等[5]的肛温监控方法。先取6只SD大鼠,同时监测大鼠脑温、肛温,求得脑温与肛温的相关方程,Y=0.946X+3.1334,其中,Y为脑温(℃),X为肛温(℃) (相关系数r=0.988,P<0.01)。以此方程校正大鼠的脑温与肛温的差别,从而确定后继实验中亚低温时相应的肛温。根据上述方法,进行大鼠温度控制。常温缺血组: 保持肛温35.8℃(相当于脑温37℃)；亚低温缺血组: 在缺血后立即采用喷洒酒精+电扇降温,在10 min内使肛温降至31.57℃(相当于脑温33℃),并维持3 h,而后使其体温回升至正常(肛温35.8℃,脑温37℃)。

1.5 方 法

采用“双侧颈总动脉阻断+低血压法”建立大鼠短暂全脑缺血模型[6]。大鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，分离双侧颈总动脉及股动静脉，进行股动静脉置管，股动脉导管连接血压换能器监测血压。手术组(包括常温缺血组和亚低温缺血组)自股静脉导管抽血，使平均动脉压降至35 mmHg左右。动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，维持平均动脉压在(35±2.5)mmHg。缺血完毕立即将血自股静脉回输。假手术组只行血管分离，不予夹闭与抽血。

将各时间组大鼠再次麻醉，行脑灌注固定，石蜡包埋，脑海马冠状面6～8 μm连续切片。

3组切片均用免疫组化SP法检测海马神经元中APE/Ref-1的表达(DAB显色)。用PBS代替一抗作阴性对照。3组切片均行TUNEL染色。用不含A液的TUNEL反应液作阴性对照。常温缺血2 d组的切片行APE/Ref-1蛋白免疫组化与TUNEL双重染色，苏木素复染。

1.6 结果判定标准

光学显微镜下观察的结果判断标准：细胞核中有棕黄色颗粒者为APE/Ref-1阳性细胞；细胞核有紫黑色颗粒者为凋亡阳性细胞；细胞核被复染成浅蓝色为既非APE/Ref-1阳性又非TUNEL阳性的细胞。每张切片高倍镜下(×400)均计数大鼠脑海马双侧CA1区各5个视野，结果用均数±标准差表示。以假手术组APE/Ref-1免疫组化阳性神经元数作为海马正常神经元数，各组阳性神经元数与之相比即为各组阳性神经元占正常的百分比。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 APE/Ref-1免疫组织化学染色结果

假手术组大鼠海马CA1区神经元广泛表达APE/Ref-1(图1)。在常温缺血后的1 d，海马CA1区APE/Ref-1阳性细胞开始减少，2 d时减少明显，3 d时仅余少许(图2)。亚低温缺血后的2 d，海马CA1区APE/Ref-1阳性细胞数目开始减少，3 d时，减少程度有所增加(图3)。与常温缺血组相比，亚低温缺血组在各时间点上APE/Ref-1 阳性细胞数目差异均有显著性意义(表1)。

图1 假手术组大鼠海马CA1区APE/Ref-1蛋白在神经元胞核中广泛表达(SP ×400)

图2 常温缺血组(存活3 d)大鼠海马CA1区APE/Ref-1蛋白表达明显减少 (SP ×400)

2.2 TUNEL 染色结果

假手术组和缺血后存活1 d 组未发现TUNEL染色阳性神经元, 缺血后存活2 d 及3 d 的常温缺血组海马CA1 区TUNEL阳性神经元较同时间亚低温缺血组的阳性神经元数目增多(P<0.01)(图4、5)。温度不同时各时间点大鼠脑海马CA1区阳性神经元数见表2。

图3 亚低温缺血组(存活3 d)海马CA1区APE/Ref-1阳性神经元 (SP ×400)

表1 常温组与亚低温组大鼠海马CA1区不同存活时间APE/Ref-1阳性神经元数比较

1)与亚低温组比较，P<0.01

图4 常温缺血组(存活3 d)大鼠海马CA1区大量TUNEL阳性神经元 (TUNEL染色 × 400)

2.3 APE/Ref-1蛋白免疫组化与TUNEL双重染色

缺血后2 d脑组织切片行APE/Ref-1蛋白免疫组化和TUNEL双重染色可观察到3种不同细胞：APE/Ref-1阳性细胞、TUNEL阳性细胞及既无APE/Ref-1阳性又无TUNEL阳性的细胞。未见TUNEL阳性与APE/Ref-1阳性同处于一个细胞中(图6)。

图5 亚低温缺血组(存活3 d)海马CA1区仅可见少许TUNEL染色阳性的神经元(TUNEL染色 × 400)

表2 常温组与亚低温组大鼠海马CA1区不同存活时间TUNEL阳性神经元数比较

1)与亚低温组比较，P<0.01

图6 常温缺血组(存活2 d)大鼠海马CA1区APE/Ref-1蛋白免疫组化与TUNEL双重染色 ×400

2.4 不同温度全脑缺血后APE/Ref-1的变化与神经元凋亡的关系

以上文得出的表1部分和表2部分中不同温度下的APE/Ref-1阳性细胞百分比与TUNEL阳性细胞百分比值为依据，作出不同温度下短暂性全脑缺血后海马CA1区APE/Ref-1阳性细胞百分比与TUNEL阳性细胞百分比随时间变化图，见图7、8。

图7 海马CA1区常温缺血后APE/Ref-1阳性细胞与TUNEL阳性细胞时间变化图

图8 海马CA1区亚低温缺血后APE/Ref-1阳性细胞与TUNEL阳性细胞时间变化图

3 讨 论

研究发现，缺血性脑中风发生早期，缺血中心区脑血流急剧下降，神经细胞死亡以坏死为主；而缺血中心区周围(缺血半暗带)的神经细胞仍然具有代谢活力，其后续的死亡以凋亡为主，其形态学表现为核固缩、胞膜发泡及凋亡小体的形成，DNA在寡核小体间裂解，在凝胶电泳时呈现明显的“DNA Ladder”[7]。

APE/Ref-1蛋白被认为是自身DNA修复机制中的关键成分，具有DNA碱基切除修复功能[8]，在脑缺血时，能修复损伤的神经元DNA，防止凋亡的发生。APE/Ref-1蛋白减少，会使得部分DNA损伤后不能得到有效的修复，导致细胞凋亡的发生。既往研究表明，APE/Ref-1蛋白表达下调的细胞，对诱发DNA损伤的各种因素敏感性增强[9]。

本研究显示，10 min的短暂性全脑缺血/再灌注引致的神经元死亡主要表现为对缺血敏感的海马CA1区巨锥体细胞的迟发性死亡。这种迟发性神经元死亡主要为凋亡，发生在缺血后的2～3 d，以3 d时明显。正常情况下，APE/Ref-1蛋白在海马神经元细胞核中广泛表达。缺血后1 d，已可观察到海马CA1区APE/Ref-1蛋白阳性细胞开始减少，2 d减少明显，3 d仅存少许。从缺血时间与阳性细胞百分比图可以看出海马CA1区APE/Ref-1蛋白的减少和TUNEL阳性细胞增多明显相关。APE/Ref-1蛋白的减少要早于TUNEL阳性细胞数增多。缺血后2 d脑组织同一张片上APE/Ref-1蛋白免疫组化和TUNEL双重染色可观察到APE/Ref-1阳性细胞、TUNEL阳性细胞及既无APE/Ref-1阳性又无TUNEL阳性的细胞，未见TUNEL阳性与APE/Ref-1阳性同处于一个细胞中。这既说明APE/Ref-1的减少要早于凋亡细胞的出现，又提示失去APE/Ref-1阳性的细胞转变为TUNEL阳性细胞。

亚低温是目前缺血后脑损伤最有效的保护措施之一[3-4]。大量的研究表明，亚低温起效的机制是多重性的，它能在多个水平上阻止脑梗死后缺血级联反应的发展，从而减少神经元坏死和凋亡，抵抗脑缺血再灌注损伤，持久的保护神经元形态和功能免受损害[10-11]。

本实验显示,与常温缺血组相比,实行亚低温的大鼠海马CA1区中APE/Ref-1 染色阳性的神经元数目在缺血后减少不明显, 再结合TUNEL 染色结果,亚低温同时也抑制神经元的凋亡。而如上述，在脑缺血后APE/Ref-1的减少要早于凋亡细胞的出现，且失去APE/Ref-1阳性的细胞转变为TUNEL阳性细胞。因此，亚低温可能通过对APE/Ref-1蛋白的保护而抑制神经元的凋亡。

APE/Ref-1蛋白被认为是自身DNA修复机制中的关键成分，因此，从本实验可以推测亚低温可能对缺血后神经元自身DNA修复机制有保护作用，且可能通过对此机制的保护而抑制神经元的凋亡。

[1] Wang Y,Jiang YF,Huang QF,et al.Neuroprotective effects of salvianolic acid B against oxygen-glucose deprivation/reperfusion damage in primary rat cortical neurons[J]. Chin Med J (Engl),2010，123(24):3612-3619.

[2] Tell G, Damante G, Caldwell D, et al. The intracellular localization of APE1/Ref-1: more than a passive phenomenon?[J].Antioxid Redox Signal,2005,7(3-4): 367-384.

[3] Linares G，Mayer SA. Hypothermia for the treatment of ischemic and hemorrhagic stroke[J].Crit Care Med,2009,37(7 Suppl):S243-249．

[4] Hoesch RE，Geocadin RG．Therapeutic hypothermia for global and focal ischemic brain injury—a cool way to improve neurologic outcomes[J]．Neurologist，2007，13(6):331-342．

[5] Maier CM, Ahern K, Cheng ML, et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia:Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis and inflammation[J]. Stroke, 1998, 29: 2171-2180.

[6] Chan PH, Kawase M, Murakami K, et al. Overexpression of SOD1 intransgenic rats protects vulnerable neurons against ischemia damage after global cerebral ischemia and reperfusion[J].J Neurosci,1998, 18:8292-8299.

[7]Mehta SL，Manhas N，Raghubir R．Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics[J].Brain Res Rev，2007，54(1):34-66．

[8] Hegde ML, Hazra TK, Mitra S.Early steps in the DNA base excision / single-strand interruption repair pathway in mammalian cells[J].Cell Res,2008,18(1):27-47.

[9] Walker LJ, Craig RB, Harris AL, et al.A role for the human DNA repair enzyme HAP1 in cellular protection against DNA damaging agents and hypoxic stress[J]. Nucleic Acids Res,1994,22(23):4884-4889.

[10]Florian B，Vintilescu R，Balseanu AT，et al．Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia[J]．Neurosci Lett,2008,438(2):180-185．

[11] González-Ibarra FP, Varon J, López-Meza EG．Therapeutic hypothermia：critical review of the molecular mechanisms of action[J]．Front Neurol，2011,2:4．