18F-FDG对于乳腺癌模型小鼠治疗作用的研究

许秦风,郭万华,李爱梅,林夏雯,贾支俊

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009；2. 南京市鼓楼医院 核医学科，江苏 南京 210008)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近几十年来在绝大多数国家其发病率及死亡率均呈持续上升趋势。目前对于乳腺癌的治疗手段除外科手术外主要包括药物化学治疗以及放射治疗等手段，两者均有靶向性差和细胞毒性大等副作用[1-2]。18F-FDG作为一种潜在的肿瘤靶向性治疗药物[3]，一方面作为葡萄糖类似物，不能经己糖异构酶催化成糖酵解的底物，不能生成ATP，堆积于细胞内，可以起到能量阻滞剂的作用，使肿瘤细胞凋亡；另一方面，18F的衰变能发射正电子，在组织内射程0.1～0.2 mm，通过湮没辐射产生γ射线，在此过程中可以使组织中的分子电离，产生氧自由基，对浓聚部位的肿瘤细胞具有一定的诱导凋亡作用，且因为其半衰期短、射程较短，对于正常细胞影响较小[4]。本课题组主要研究适当剂量18F-FDG诱导乳腺癌凋亡，并探讨其凋亡作用及可能凋亡分子机制。

1 材料和方法

1.1 试 剂

人乳腺癌MCF-7细胞株由本院肿瘤科赠予，胎牛血清购自杭州四季青公司，LG-DMEM、胰酶粉购自GIBCO公司，细胞培养瓶、细胞培养板购自Corning公司，18F-FDG购自南京安迪克公司，Pierce23225BCA Protein Assay Kit/BCA蛋白浓度测定试剂购自Pierce 公司，PM0671 Prestained Protein Ladder(10-170kD) 购自杭州联科生物公司，anti BCL-2及CASPASE-3、β-actin，Sheep polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG - H&L (HRP)购自ABCAM公司，PVDF膜及Immobilon Western HRP底物购自Millipore公司。

1.2 实验动物及设备

雌性Balb/c小鼠24只，2周龄，购自南京大学实验动物中心，并在本院动物实验中心饲养。γ射线高能计数仪及micro-animal PET-CT(无锡原子能研究所)，小型垂直电泳及转膜设备(BIO-RAD公司)，Tanon4200数码凝胶图像处理系统(Tanon公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 MCF-7细胞培养及细胞体外18F-FDG摄取实验：培养条件为10 %胎牛血清， LG-DMEM 培养基，于37℃，5 % CO2细胞培养箱中培养。细胞体外摄取实验在对数生长期进行，分别加入0、1.85×106、3.7×106、7.4×106Bq/mL18F-FDG，孵育1 h，分别做复管，然后使用胰酶消化，PBS冲洗3遍，洗去游离的18F-FDG，最后用γ射线高能计数仪测定细胞摄取放射剂量。

1.3.2 动物模型的建立：在4周左右健康雌性Balb/c小鼠右侧腋下接种MCF-7细胞悬液，约107个细胞/只，继续饲养于SPF级动物房，观察肿瘤的生长情况。待肿瘤直径达到0.5～0.6 cm左右时(10～12 d)，开始后续实验。

1.3.3 分组用药治疗并制作肿瘤生长曲线：将建立好模型的24只小鼠随机分为4组，每组6只，将其中3组小鼠分别经尾静脉注射3.7 MBq、11.1 MBq、37 MBq18F-FDG进行治疗，对照组小鼠注射等体积生理盐水作为对照，每2天观察小鼠情况并以游标卡尺测量瘤体长、短径(a，b)，肿瘤体积V=π/6×ab2，取其均数绘制肿瘤生长曲线，22 d后观察各组小鼠一般状况，进行后续显像。

1.3.4 分组micro-animal PET/CT显像：持续NO2麻醉，每只裸鼠分别向其尾静脉注射18F-FDG 约150 μci。1 h后对注射进行荷瘤裸鼠的PET/CT(Gemini，Philips，The Netherland)显像。显像结束后将所有小鼠处死，取出瘤体冻存于-80℃备用。

1.3.5 Western Blot 分析: BCA 法蛋白定量， 取总蛋白相等(50 mg)的样品行12% SDS-PAGE 电泳，然后电转印至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶(TBST稀释)封闭2 h后加入一抗(1∶500稀释)于4℃孵育过夜， 使用TBST 缓冲液洗涤3 次、每次10 min， 加入二抗(1∶3000稀释)于室温下孵育2 h， 再用TBST缓冲液洗涤3 次、每次10 min， 加入发光底物(ECL)显色， 以β-actin 作内参照，每组实验重复3次，最后用条带分析软件Quantity One进行光密度值分析。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 MCF-7细胞体外摄取实验

在一定剂量范围内，随着射线剂量的增加，处于对数生长期的MCF-7细胞摄取射线剂量逐渐增加，基本呈线性增长(图1)。

图1 MCF-7细胞体外摄取18F-FDG结果Fig 1 Uptake of γ-ray by MCF-7 cells in vitro

2.2 治疗后乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤体积增长曲线

治疗后，各治疗组小鼠肿瘤体积增长速度明显放缓，而较高剂量组(11.1 MBq与37 MBq)较之较低剂量组(3.7 MBq)显示出更低的增长速度，与之相反，注射生理盐水的对照组小鼠肿瘤体积增长明显，呈明显的上升态势，见表1。

2.3 乳腺癌荷瘤裸鼠 micro-animal PET显像

肿瘤均位于右腋下皮下，均呈不同程度的放射性浓聚，治疗组浓度程度低于对照组，且随着之前治疗时注射药物剂量的增加，放射性浓聚的程度也随之降低(图2)。

表1 注射18F-FDG后各组小鼠肿瘤体积变化Tab 1 Dynamic changes of xenogafts volume in different group mice

表1 注射18F-FDG后各组小鼠肿瘤体积变化Tab 1 Dynamic changes of xenogafts volume in different group mice

datecontrol18F-FDG(3．7MBq)18F-FDG(11．1MBq)18F-FDG(37MBq)00．06±0．010．07±0．010．06±0．010．08±0．0120．30±0．020．19±0．011)0．13±0．021)0．12±0．011)2)40．53±0．040．26±0．021)0．19±0．041)0．17±0．021)2)60．96±0．130．65±0．051)0．47±0．071)0．26±0．021)2)81．57±0．450．79±0．071)0．59±0．111)0．33±0．021)2)102．73±0．781．49±0．131)0．84±0．171)0．47±0．131)2)123．56±0．972．07±0．431)1．19±0．391)0．56±0．171)2)145．73±1．252．19±0．441)1．58±0．771)0．66±0．281)2)

1)与对照组比较，P<0.05；2)与3.7 MBq 18F-FDG剂量组比较，P<0.05

图2 乳腺癌荷瘤裸鼠PET显像Fig 2 Images of model mouse by microPET

2.4 18F-FDG对于乳腺癌荷瘤裸鼠BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白表达的影响

注射18F-FDG之后：各治疗组的乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体cleaved CASPASE-3表达均高于对照组(P<0.05)，BCL-2表达均低于对照组(P<0.05)；11.1 MBq剂量组与37 MBq剂量组间该两种蛋白表达差异均无显著性意义(P>0.05)，但11.1 MBq剂量组与37 MBq剂量组cleaved CASPASE-3表达均高于3.7 MBq剂量组，BCL-2表达均低于3.7 MBq剂量组，差异具有显著性意义(P<0.05)。见表2、图3。

表2 BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白表达条带光密度半定量扫描结果Tab 2 BCL-2 and cleaved CASPASE-3 OD values in xenografts

1)与对照组比较，P<0.05；2)与3.7 MBq18F-FDG剂量组比较，P<0.05

图3 18F-FDG对于乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白的表达Fig 3 Effects of 18F-FDG on expressions of BCL-2 and cleaved CASPASE-3 in xenografts

3 讨 论

18F-FDG是2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)在2位上H或是葡萄糖第2位上的羟基被F替代的形式。作为一种葡萄糖类似物，FDG会被脑、肾脏以及肿瘤细胞等葡萄糖高利用率细胞(high-glucose-using cells)所摄取。在这些细胞内，磷酸化过程将会阻止FDG以原有形式从细胞之中释放出来，所以，18F-FDG 的分布情况就会很好地反映体内细胞对葡萄糖的摄取分布情况。目前已经广泛用于正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography，PET)成像以进行恶性肿瘤的筛查、诊断、分期、疗效检测及预后评估[5]。研究表明，2-脱氧-D-葡萄糖在葡萄糖转运蛋白进入细胞后所生成的2-脱氧-6-磷酸葡萄糖，不能经己糖异构酶催化，也不能生成ATP提供能量，只能滞留于细胞内。基于以上原理，2-DG可能作为葡萄糖的竞争性无效能量底物发挥切断肿瘤的能量供应的作用，从而达到加速肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长的作用[6]，已有文献证实其对于淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞等多种肿瘤细胞有促凋亡作用，而且2-DG可以增强肿瘤细胞对于如射线、抗肿瘤药物等各种外界影响因素的敏感性[7-9]；同时18F 发出的平均能量为0.250 MeV、丰度为96%的β+射线(正电子)以及其湮没辐射发射的高能γ射线对非常邻近的周围组织有辐射作用，尽管18F 半衰期较短，但由于其在肿瘤摄取后富集的靶与非靶比值非常高，其细胞电离毒杀肿瘤作用是不可忽视的，且由于作用距离较短，故而对于周围邻近正常组织损害相当有限[4，10]。根据本次实验，体外培养相同数量级的MCF-7细胞对18F-FDG的摄取与射线剂量在一定剂量内呈线性相关，随着18F-FDG剂量的增加，MCF-7细胞所摄取γ射线的计数会随之增加，由此可知18F-FDG确会在肿瘤细胞内浓聚，从而达到形成辐射杀伤作用以及能量竞争底物的作用。本次PET显像显示，在乳腺癌荷瘤裸鼠模型中，肿瘤部位形成较明显的放射性高摄取，提示18F-FDG在肿瘤区域浓聚，而治疗组小鼠肿瘤部位放射性浓聚程度低于对照组，提示肿瘤生长受到抑制，葡萄糖代谢水平减低，肿瘤细胞的活性减低。由此可见，显像剂既可起到筛选呈阳性显像个体的作用，亦能起到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。而对于各组实验动物的持续观察和肿瘤体积的记录显示，本次实验中，各剂量组治疗效果均优于对照组，而11.1 MBq剂量组与37 MBq剂量组治疗效果又优于3.7 MBq剂量组。这证明18F-FDG 确实可杀伤实验动物体内的乳腺癌细胞，起到一定的治疗作用。

细胞凋亡与坏死不同，是机体在生长、发育过程中或受到有害刺激时清除多余的、衰老的或异常的细胞，以保持机体内环境稳定和维持正常生理活动的一种细胞主动死亡形式。其中CASPASE的级联反应是凋亡的基本过程，CASPASE蛋白通常以酶原(pro-CASPASE)形式存在，其分子结构包括N端结构域、大亚基和小亚基，水解后分离出的大小亚基可以形成四聚体而成为具有蛋白水解酶活性的CASPASE，CASPASE-3作为下游的效应蛋白，起到凋亡过程中不可替代的作用，其阳性表达意味着细胞正在进行着不可逆的凋亡过程。BCL-2蛋白主要位于核膜、内质网及线粒体外膜上，是一种抗凋亡蛋白，其过表达可抑制许多因素诱导的多种细胞凋亡，从而明显延长细胞的生存期，促进恶变，引发肿瘤的形成；抑制肿瘤BCL-2蛋白的表达可以促进肿瘤细胞的凋亡，并且可以升高肿瘤细胞对于多种抗肿瘤药物的敏感性，原因在于BCL-2 蛋白水平下降将使线粒体膜去极化，破坏线粒体的完整性，释放线粒体内的促凋亡因子，最终激活CASPASE-3，导致细胞凋亡，同时BCL-2也是CASPASE-3的作用底物，可以被CASPASE-3水解。据文献报道，18F-FDG对于癌细胞的促凋亡作用是受到BCL-2家族蛋白调控的[11-13]。本研究用Western Blot法检测了注射18F-FDG 之后乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体CASPASE-3蛋白及BCL-2蛋白的表达情况，显示BCL-2蛋白表达降低，cleaved CASPASE-3表达有所增高，提示18F-FDG可能通过下调BCL-2蛋白的表达，上调CASPASE-3蛋白的表达促进了细胞的凋亡；18F-FDG剂量的提高(3.7 MBq～11.1 MBq、37 MBq)引起BCL-2蛋白表达的降低和CASPASE-3蛋白表达的提高，提示了在某一剂量范围内，18F-FDG可能靠剂量依赖诱导BCL-2蛋白表达降低从而促进肿瘤细胞凋亡。

本次实验中，11.1 MBq剂量组与37 MBq剂量组治疗效果未见统计学差异，与Western Blot结果一致，推测18F-FDG对于肿瘤的治疗效果并不会随着给药剂量的增加而呈线性增长，并且本次实验为单次给药，其结果亦有可能产生偏倚。此外，由于部分正常组织对于18F-FDG亦表现出高摄取，如正常心脏、脑以及肾脏组织等，虽然正常细胞具有一定修复功能，相对来说受到辐射及代谢因素的影响较小，但是受到的损伤始终是存在的，因此如果今后18F-FDG要应用于临床，必须要进一步明确最佳的治疗剂量以及药物对于体内其他正常脏器的影响，这还有待进一步研究。

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