NaCl胁迫对烤烟叶肉细胞超微结构的影响

王程栋，王树声*，胡庆辉，赵洪东，王春生，邵理祥

（1.农业部烟草生物学与加工重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.山东中烟工业有限责任公司，济南250100；3.山东日照烟草有限公司，山东 日照 276826）

光合作用提供植物生命活动所需的基础能量，是植物获得能量的主要来源，但光合器官对外界胁迫反应比较敏感，尤其是盐胁迫会直接影响光合机构的结构与活性，使植物光合作用下降[1]。

植物叶片结构与其抗逆性密切相关，细胞也具有与之相适应的超微结构[2-3]，逆境胁迫促使叶片细胞改变细胞器结构以应对不利条件，而目前研究盐胁迫对叶片细胞超微结构的影响主要集中在采收籽粒为主的作物上，且多在籽粒成熟期研究生殖生长对其结构的影响，而烤烟作为重要的经济作物，以收获叶片为主要耕作目标，目前对于烤烟等采收叶片的作物研究较少，特别是在受盐胁迫时烤烟叶肉细胞超微结构变化规律方面研究薄弱。本研究以烤烟品种NC89为材料，通过分析NaCl胁迫对叶肉细胞超微结构的影响，从解剖学角度揭示盐胁迫对烤烟细胞结构的影响，探讨烤烟叶片超微结构对盐胁迫的反馈机制，为烤烟的耐盐机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与盐胁迫处理

试验于 2010年在中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地温室内进行，供试烤烟品种为NC89，采用Hoagland营养液进行砂培。打顶后，使用350 mmol/L的NaCl / Hoagland营养液进行为期8 d的盐胁迫处理，Hoagland营养液为对照，每次浇灌250 mL，3次重复。

1.2 电镜制样及观察测量

在盐胁迫0、2、4、6、8 d后取中部烟叶作为观察材料，在叶中部主脉附近切下2 mm×2 mm的叶片，4% Glutaraldehyde和1% Osmiumtetroxide分别进行前、后固定，使用PBS进行清洗并梯度酒精脱水，采用环氧丙烷置换，Epon 812包埋，超薄切片，采用醋酸铀和柠檬酸铅对染染色，Hitachi C-7000透射电镜观察拍照。

叶绿体基粒类囊体垛叠数观测：在透射电镜下每个处理选择 10个有代表性的叶绿体，每个叶绿体选择1个基粒，记录所选基粒的类囊体垛叠数并测量长度。

2 结 果

2.1 叶绿体形态变化

对照叶绿体沿细胞壁边缘排列，长轴与细胞壁平行，形态饱满，结构完整，基质浓厚，叶绿体片层成平行排列，结构整齐，叶绿体膜系统结构完整，基粒类囊体垛叠均大于15，生理活性强，含较多小淀粉粒（图1①）。试验发现，叶绿体形态并未随处理时间的增加而发生明显改变，处理后2、4、6、8 d共4次取样，其类囊体垛叠数呈现作物自然衰老时的缓慢变化规律[4]，几个时期样品垛叠数差异不显著（图2、3）。

NaCl处理2 d叶片细胞叶绿体片层结构清晰，形状略有改变，部分观察到扭曲变形，但类囊体排列有序，通过对基粒垛叠数及类囊体长度进行测量，两者均未见明显减小，叶绿体内淀粉粒发育充盈，切片时出现切痕（图1②）。

NaCl处理4 d叶片细胞叶绿体片层结构松散，部分膜变得模糊，同时，基粒片层松散、变形，有断裂的现象，可明显观察到片层之间的离散，垛叠之间出现明显空隙，失去清晰的片层结构（图1③）。

NaCl处理6 d叶片细胞叶绿体结构松散，进一步肿胀、变形，失去完整结构，不再具有与细胞质之间的明显界限，同时，嗜锇颗粒增多，体积变大，基粒片层出现断裂，扭曲、变细，可观察到丝状片层，整体结构紊乱（图1④），淀粉粒膨大。

图1 叶绿体超微结构变化Fig.1 Change of chloroplasts ultra structure

图2 350 mmol/L NaCl胁迫对基粒类囊体垛叠数的影响Fig.2 Effect of 350 mmol/L NaCl stress on thylakoid number in grana

图3 350 mmol/L NaCl胁迫后基粒类囊体长度变化Fig.3 Effect of 350 mmol/L NaCl stress on thylakoid length in grana

NaCl处理8 d后，部分叶片细胞叶绿体基本无法观察到整齐的片层结构，但其淀粉粒发育较好，与自然衰老的叶肉细胞相比，未见明显的被膜破裂。

2.2 线粒体形态变化

对照叶肉细胞线粒体呈球形，形态饱满，双层膜结构完整，可观察到内膜凹陷形成的嵴，被膜完整，基质丰富，随处理时间的延长，大部分线粒体仍保持较好状态，结构未发生明显变化（图4①）。

NaCl处理2 d线粒体结构完整，内膜系统未见明显破坏，外形近球形，形态饱满，可明显观察到内膜凹陷，与对照相比，部分膜模糊，但整体上差异不大（图4②）。

NaCl处理4 d线粒体嵴没有明显的减少，外膜结构完整，部分线粒体呈扁球形，此时与对照相比，内膜系统可观察到较多的嗜锇颗粒，部分膜模糊，但线粒体的内、外膜及嵴仍清晰可见（图4③）。

NaCl处理6 d内膜破坏更为严重，嵴的数量进一步减少，且嗜锇颗粒增加明显，内、外膜膨胀，与对照相比，部分线粒体无法清晰辨认出内、外膜间的界限，电镜下观察线粒体着色不均（图4④）。

NaCl处理8 d后，线粒体结构崩溃，大部分内膜已经破裂，无结构清晰的嵴，内部绝大部分为空泡，但大多数外膜保持完整，发现了少数外膜破裂的情况（图4⑤，4⑥）。

图4 线粒体超微结构变化Fig.4 Change of mitochondrial ultra structure

2.3 其他超微结构变化

对照叶片细胞核液浓度较高（图5①），随胁迫时间的增加，核液浓度不断降低，胁迫4 d时，核内即出现明显的异染色质化，但仍可见清晰的核仁（图5②）；随着胁迫时间的延长，异染色质化程度逐渐加深，与对照相比差异显著（图5③）。

此时细胞内多数细胞器已失去完整结构，同时伴随出现大量的电子密集的沉积物（图5④），且出现了明显的质壁分离（图5⑤），液泡所占细胞比例变小，细胞质膜出现断裂破损，细胞内有大量的嗜锇颗粒（图5⑥）。

3 讨 论

据报道，光温水等外界环境均会对叶绿体超微结构产生影响，而叶绿体对盐分也极为敏感[5]。植物在受到盐胁迫伤害时，叶绿体膜极易被破坏[6-7]。未进行盐胁迫处理时，叶绿体结构较好，基粒片层清晰，类囊体完整，胁迫处理后叶绿体结构松散、变形，基粒片层模糊，破坏严重的基粒片层扭曲，失去完整结构[8-9]，此变化规律在大麦、小麦、水稻、甘薯[10-12]等作物上均被证实。本研究在烤烟上同样观察到叶绿体结构随着 NaCl胁迫时间的增加，变化越明显，老化速度加快，片层逐渐解体，嗜锇颗粒增大、增多，结构趋向简单。由于胁迫后细胞膜两侧渗透压发生改变，进而影响到细胞正常的生理代谢，叶绿体功能紊乱，其排列位置也发生了变化。

线粒体是细胞能量的供给者，曾经被认为是对胁迫不敏感的细胞器[13-14]，但笔者观察发现，烤烟细胞线粒体对盐胁迫比较敏感，胁迫后线粒体外形首先改变，由较规则的球形变为近椭圆形，同时内膜系统开始降解，逐步丧失完整结构。

植物在适应外界环境改变时，其细胞整体结构会发生相应改变，比如细胞膜与细胞壁之间增加接触面积，形成较为牢固的结合点和稳定的结构，确保胁迫时细胞质膜与细胞壁结合紧密[15-16]，降低或减少质壁分离的发生[17]，同时细胞核变大。在部分作物中还发现了质膜向细胞内方向凹陷，形成囊泡[18]，以降低盐分对细胞正常生理活动影响的现象。笔者发现，盐胁迫导致烤烟叶片细胞整体结构破坏严重，除上述叶绿体和线粒体外，细胞质膜稳定性、细胞核形态、液泡充盈程度、细胞质状态也发生明显变化，在此过程中，细胞质膜与细胞壁之间没有发生结构上的变化，而发生了明显的质壁分离，最终大液泡体积变小，导致细胞质膜破损、模糊，稳定性下降，这些结构的改变说明烤烟在盐胁迫条件下自身抵抗能力不强。

图5 其他细胞器超微结构变化Fig.5 Change of other organelle ultra structure

4 小 结

随胁迫时间的加长，烤烟叶肉细胞叶绿体受损严重，处理6 d后类囊体平均长度降到0.2042 μm，与对照相比，胁迫后第6 d类囊体垛叠数即明显降低，基质浓度下降，嗜锇颗粒增加。与自然衰老相比，盐胁迫对烤烟细胞类囊体结构变化影响较大，内膜系统降解更为彻底，但外膜完整性保持较好，处理8 d后基粒完全降解时，叶绿体被膜未见明显破裂。线粒体在盐胁迫条件下结构被严重破坏，处理4 d后内膜系统即明显观察到受损，外形变化明显，嵴减少，处理8 d后内膜完全降解，部分线粒体可观察到外膜受损，与自然衰老相比，内膜系统破坏较重。此外，烤烟叶片细胞核液浓度随着胁迫时间的增加不断降低，核内异染色质化明显，且随着胁迫时间的延长异染色质化与对照相比差异显著，并同时伴随出现大量的电子密集的沉积物。

[1]刘祖祺，张石城.植物抗性生理学[M].北京：中国农业出版社，1994：222-223.

[2]谷瑞升，蒋湘宁，郭仲琛.胡杨细胞和组织结构与其耐盐性关系的研究[J].植物学报，1999，41（6）：576-579.

[3]Kramer D.Cytological aspects of salt tolerance in higher plants[M]//Steples R C, Toenniessen G H.Salinity tolerance in plants: strategies for crop improvement.New York: John Willey and Sons, 1984: 3-15.

[4]黄勇，周冀衡，郑明，等.不同成熟度烟叶结构显微分析[J].中国烟草科学，2008，29（2）：5-8.

[5]李扬汉.植物学[M].上海：上海科学出版社，1984：31-35.

[6]朱守旌，张勇.盐胁迫下小花碱茅超微结构的研究[J].中国草地，2000（4）：30-32.

[7]秘彩莉，黄占景，邵素霞，等.近似等位基因系小麦盐胁迫下叶绿体超微结构下比较研究[J].电子显微学报，2001，20（2）：98-101.

[8]夏富才，姜贵全，陆静梅.盐生植物抗盐结构机理研究进展[J].通化师范学院学报，2002，23（2）：67-69.

[9]孟凡娟，王建中，黄凤兰，等.NaCl盐胁迫对两种刺槐叶肉细胞超微结构的影响[J].北京林业大学学报，2001，32（4）：97-102.

[10]龚明，丁念诚，贺子义，等.盐胁迫下大麦与小麦叶片脂质过氧化伤害与超微结构变化的关系[J].植物学报，1989，31（11）：841-846.

[11]柯玉琴，潘廷国.NaCl胁迫对甘薯叶片叶绿体超微结构及一些酶活性的影响[J].植物生理学报，1999，25（3）：229-233.

[12]华春，王仁雷.盐胁迫对水稻叶片光合效率和叶绿体超显微结构的影响[J].山东农业大学学报：自然科学版，2004，35（1）：27-31.

[13]戴伟民，赵艳，蔡润，等.番茄耐盐愈伤组织的筛选及显微结构观察[J].上海交通大学学报：农业科学版，2001，19（2）：112-116.

[14]左志锐，高俊平，穆鼎，等.盐胁迫下百合两个品种的叶绿体和线粒体超微结构比较[J].园艺学报，2006，33（2）：429-432.

[15]张国，时向东，季学军，等.皖南砂壤土和水稻土烤烟叶片组织结构发育规律研究[J].中国烟草科学，2011，32（6）：37-42.

[16]朱英华，屠乃美，肖汉乾，等.酸性pH条件对烤烟生理指标及叶片组织结构的影响[J].中国烟草科学，2011，32（4）：46-50.

[17]韦存虚，王建军，王建波.Na2CO3胁迫对星星草叶肉细胞超微结构的影响[J].生态学报，2006，26（1）：108-114.

[18]刘义新，陶涌，孟丽华，等.烤烟品种 K326 和云烟87 对镉胁迫的生理响应及抗性差异[J].中国烟草科学，2008，29（4）：1-5.