茶多酚二甲亚砜合剂对铀矿尘人支气管细胞毒性的防护作用

黄波，龙颖，邱劲松，黄云，胡建安

(1.中南大学公共卫生学院，湖南长沙410078;2.南华大学公共卫生学院，湖南衡阳421001)

茶多酚二甲亚砜合剂对铀矿尘人支气管细胞毒性的防护作用

黄波1，2，龙颖2，邱劲松2，黄云2，胡建安1

(1.中南大学公共卫生学院，湖南长沙410078;2.南华大学公共卫生学院，湖南衡阳421001)

目的探讨铀矿尘所致人支气管细胞BEAS-2B细胞DNA损伤以及茶多酚二甲亚砜合剂对细胞的防护作用。方法BEAS-2B细胞中加入铀矿尘、铀矿尘+茶多酚、铀矿尘+二甲亚砜、铀矿尘+茶多酚二甲亚砜合剂染毒24 h后，通过检测微核和多核细胞观察染色体损伤，彗星实验及H2AX蛋白磷酸化检测DNA的损伤，多核细胞法检测细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)突变。结果与正常对照组相比，BEAS-2B细胞经铀矿尘染毒后，细胞的微核率、多核率和拖尾率明显升高，H2AX蛋白磷酸化表达增高，HPRT突变率明显增高(P＜0.05)，铀矿尘+茶多酚、铀矿尘+二甲亚砜和铀矿尘+茶多酚二甲亚砜合剂保护能有效降低上述变化(P＜0.05)，其中茶多酚二甲亚砜合剂的保护效果最好。结论铀矿尘对BEAS-2B细胞DNA具有损伤作用，茶多酚二甲亚砜合剂有较强防护作用。

铀;茶多酚;二甲亚砜;DNA损伤

铀(uranium)矿粉尘及其氧化物可通过呼吸道及消化道进入人体形成内辐射，从而发生辐射效应。前期研究发现，铀矿尘能诱发人支气管细胞BEAS-2B氧化损伤，二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和茶多酚(tea polyphenol，TP)一定程度上均能降低这种损伤［1－2］。本研究通过制备TP和DMSO合剂，采用BEAS-2B细胞作为靶细胞，研究TP和DMSO合剂对铀矿尘染毒BEAS-2B细胞的防护作用，为铀矿尘损伤的医学防护新药开发提供有益的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

BEAS-2B细胞，本实验室保存。铀矿尘从南华大学核工业铀矿溶浸采矿重点实验室(铀的含量为4.52‰)获得，DMSO和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)购自Sigma公司，茶多酚从无锡太阳绿保科技有限公司获得。铀矿尘用玛瑙研钵研磨后，经500目筛过筛，高温高压消毒后用无血清培养液LHC-8配成5 g·L－1混悬液。

1.2 细胞分组和染毒

将指数生长期的BEAS-2B细胞分为5组:正常对照组、铀矿尘组、TP保护组、DMSO保护组、TP+DMSO合剂保护组。铀矿尘组细胞加入铀矿尘1.0 g·L－1染毒;TP保护组、DMSO保护组和TP+DMSO合剂保护组先分别加入TP 250 mg·L－1，0.5%DMSO和0.5%DMSO+TP 250 mg·L－1，在37℃下孵育2 h后，再分别加入铀矿尘1.0 g·L－1，染毒24 h。

1.3 微核多核细胞检测

细胞染毒后，用冰冷的PBS洗净，固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)固定15 min，Giemsa染色后，在油镜下观察细胞，计数每1000个细胞中微核细胞数和多核细胞数。

1.4 中性单细胞凝胶电泳实验

实验分组与染毒同上，染毒24 h后，收集细胞制成悬液;取100 μl密度为1%正常熔点琼脂糖滴至磨砂玻片上，4℃冷却10 min;取10 μl密度为5×108L－1上述细胞悬液与60 μl低熔点的琼脂糖混匀滴在第一层琼脂糖上，4℃冷却10 min;在第二层上再滴上60 μl低熔点的琼脂糖，盖上盖玻片置于4℃冷却10 min;将玻片放入4℃细胞裂解液中裂解2 h;用0.5%TBE(pH 8.2～8.5)漂洗3次，每次1 h;玻片置于中性缓冲液中，4℃电泳30 min(25 V，5 mA);PI染色15 min，Olympus荧光显微镜绿色激发光下观察并拍照;用CASP软件分析彗星细胞数目。

1.5 Western印迹法检测磷酸化H2AX(Ser139)蛋白表达

细胞染毒后，消化离心，收集细胞，加入蛋白裂解液，室温裂解后，离心，收集蛋白。常规Western印迹检测磷酸化H2AX(Ser139)蛋白表达水平(15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.22 μm NC膜)，用β肌动蛋白作为内参。

1.6 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase，HPRT)基因突变检测

细胞染毒后，用PBS洗净，换新鲜的培养液，培养至第5代时，分为两部分，一部分加入终浓度为6-TG 0.1 mmol·L－1的LHC-8培养液，37℃培养30 h;同时向两部分加入细胞松弛素B(cytochalasin B)6 mg·L－1，继续培养42 h;胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)固定;细胞悬液滴片，Giemsa染色，干燥后，光镜下计数5000个细胞，记录在同一胞浆内具有完整核膜的双核或多核细胞(包括相压、相切和分离的双核或多核细胞数)。含有6-TG培养细胞中的1000个细胞中双核或多核细胞数除以不含6-TG培养的1000个细胞中双核或多核细胞数，所得结果为HPRT基因位点突变频率(‰)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 茶多酚二甲亚砜合剂对铀矿尘致细胞微核多核发生的影响

由表1可见，与正常对照组比较，铀矿尘1.0 g·L－1能诱发BEAS-2B细胞微核细胞数及多核细胞数增加(P＜0.05)。与铀矿尘组相比，TP，DMSO和TP+DMSO合剂保护组对铀矿尘诱发BEAS-2B细胞微核细胞数及多核细胞数增加有明显的抑制作用(P＜0.05)。其中，TP+DMSO合剂保护组的抑制作用较TP保护组和DMSO保护组更为明显(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of tea polyphenol(TP)and dimethylsulfoxide(DMSO)mixture on micronuclei increase induced by uranium dust

2.2 茶多酚二甲亚砜合剂对铀矿尘致细胞拖尾数增多的抑制作用

由表2可见，与正常对照组相比，在彗星实验中，可见铀矿尘诱发BEAS-2B细胞拖尾数和尾部DNA含量明显增加，彗星尾长明显延长(P＜0.05)，表明铀矿尘对BEAS-2B细胞DNA具有明显的损伤作用。与铀矿尘组相比较，TP，DMSO和TP+DMSO合剂保护组对铀矿尘诱发的细胞DNA的损伤具有明显的抑制作用(P＜0.05)。TP+DMSO合剂保护组的抑制作用较TP保护组和DMSO保护组更为明显(P＜0.05)。

2.3 茶多酚二甲亚砜合剂对磷酸化H2AX蛋白表达的影响

由图1可见，而H2AX(Ser139)蛋白表达条带中，铀矿尘组灰度最高;TP，DMSO和TP+DMSO合剂保护组条带灰度均低于铀矿尘组，其中以TP+DMSO合剂保护组灰度最低。表明铀矿尘能诱发BEAS-2B细胞H2AX(Ser139)磷酸化增加，具有较强的损伤DNA能力;而TP，DMSO和TP+DMSO合剂保护组能有效减少H2AX(Ser139)磷酸化，具有抑制DNA损伤的能力，其中TP+DMSO合剂保护组的保护作用最强。

Tab.2 Effect of TP and DMSO mixture on increased number of tailing cells induced by uranium dust

Fig.1 Effect of TP and DMSO mixture on phospho-histone H2AX increased expression induced by uranium dust by Western blotting.Lane 1:normal control;lane 2:uranium+TP+DMSO;lane 3:uranium+DMSO;lane 4:uranium+TP;lane 5:uranium.B was the seniquantitative result of A.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with uranium group.

2.4 茶多酚二甲亚砜合剂对HPRT基因突变的影响

表3结果表明，与正常对照组相比，铀矿尘组可引起细胞HPRT基因突变率显著增高(P＜0.05);与铀矿尘组相比，TP，DMSO，TP+DMSO合剂保护组可抑制铀矿尘引起的突变率增高(P＜0.05)。

Tab.3 Effect of TP and DMSO mixture on uranium dustinduced hypoxanthine phosphoribosyltransferase(HPRT)gene mutation rate

3 讨论

铀矿粉尘可使铀矿工肺癌高发［3－4］，但其致癌机制尚未明了。由于铀矿尘的接触人群多，影响长远，因此铀矿尘的毒性机制研究及相关医学防护制剂的研制是亟待解决的问题。

本研究发现，BEAS-2B细胞经铀矿尘染毒后与正常对照组比较细胞的微核率、多核率和拖尾率升高，H2AX蛋白磷酸化表达增高，HPRT突变率增高，3个保护组能有效降低上述变化，其中TP+DMSO合剂保护组的保护效果最好。说明TP+DMSO合剂对铀矿尘引起的DNA和染色体损伤具有较强的保护作用。

众多研究表明，HPRT基因突变与肿瘤的发生有关，HPRT基因的突变广泛存在于环境中，基因重组是引起肿瘤发生的重要机制。细胞DNA错配修复(mismatch repair)系统功能缺陷的人类肿瘤细胞自发HPRT突变频率比功能正常的肿瘤细胞高50～750倍［5－6］。

γ-H2AX的形成是一个快速敏感的细胞反应，当环境和代谢等因素使细胞和动物体内的染色质DNA发生双链断裂时，SQ基序的139位丝氨酸残基快速发生磷酸化形成γ-H2AX。因此，可以根据γ-H2AX的表达高低来判断细胞DNA受损的情况［7－8］。

TP是从绿茶中提取的多酚类化合物，具有强大的清除自由基和抗氧化性能，生物学作用广泛［9－10］。加入TP后对铀矿尘诱发BEAS-2B细胞内外活性氧的增高具有明显抑制作用，乳酸脱氢酶的外溢也大大减少，从而有效地抑制了遗传毒性。

DMSO是优良的双亲性强的极性有机溶剂，作为自由基清除剂和辐射损伤保护剂的应用研究颇受关注。Huang等［11］发现，其对铀矿尘诱发BEAS-2B细胞内外活性氧增高、DNA损伤和体外转化有明显抑制作用。DMSO对铀矿尘作用于BEAS-2B细胞后，可引起细胞DNA的断裂，造成细胞拖尾率、彗星尾部DNA含量、尾长、尾部面积和尾距增加具有较好的抑制作用［1］。

由于体内的自由基反应是链式反应，利用复合式抗氧化剂抑制自由基对生物体的损伤已成为国内外新的研究热点。具有不同的活性、存在形式、作用位点、相对分子质量大小和脂水溶解性质的抗氧化剂或自由基清除剂之间有相互替代补充和协同增强作用。在本研究中也发现TP+DMSO合剂的防护效果最好。

［1］Li SZ，Huang B，Huang R，He XP.The protection of DMSO to cytotoxic of human bronchial epithelial cell caused by uranium mine dust［J］.China Med Eng(中国医学工程)，2008，16(1):26-28，31.

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Protection of tea polyphenol and DMSO mixture against uranium dust-induced cytotoxicity in human bronchial epithelial cells

HUANG Bo1，2，LONG Ying2，QU Jin-song2，HUANG Yun2，HU Jian-an1
(1.College of Public Health，Central South University，Changsha410078，China;2.College of Public Health，University of South China，Hengyang，421001，China)

OBJECTIVETo observe the uranium dust-induced DNA damage in BEAS-2B cells and the protective effect of tea polyphenol(TP)and DMSO mixture.METHODSUranium dust，uranium+TP，uranium+DMSO，uranium+TP+DMSO were added into BEAS-2B cells for 24 h.Chromosomal damage was observed by micronucleus and multinuclear cells，DNA damage by comets assay，and expression of H2AX phosphorylated proteins and hypoxanthine phosporibosyltransferase(HPRT)gene mutations were assayed by multinucleated cell method.RESULTSCompared with normal control group，the micronucleus rate，multinuclear rate，tailing rate，expression of H2AX protein phosphorylation and HPRT gene mutation rate in BEAS-2B cells were significantly increased(P＜0.05)after BEAS-2B cells were exposed to uranium dust.Uranium+TP，uranium+DMSO and uranium+TP+DMSO effectively reduced the changes(P＜0.05).Uranium+TP+DMSO mixture had the best protective effect.CONCLUSIONUranium dust can cause DNA damage in BEAS-2B cells.TP and DMSO mixture has a stronger protective effect.

uranium;tea polyphenol;dimethyl sulfoxide;DNA damage

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81072331);and Hunan Provincial Department of Education Research Fund(07C619)

HU Jian-an，E-mail:jiananhu@xysm.net，Tel:(0731)84805460

R965.3

A

1000-3002(2012)04-0546-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.014

国家自然科学基金(81072331)，湖南省教育厅科研基金(07C619)

黄波(1974－)，博士研究生，副教授，主要从事环境化学致癌及其医学防护研究;胡建安(1955－)，博士，教授，博士生导师，主要从事环境化学物毒性作用研究。

胡建安，E-mail:jiananhu@xysm.net，Tel:(0731)84805460

2011-11-29接受日期:2012-03-21)

(本文编辑:付良青)