基于系统生物学的药物毒理学研究进展

楼宜嘉

(浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江杭州310058)

基于系统生物学的药物毒理学研究进展

楼宜嘉

(浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江杭州310058)

近年来涉及系统生物学的毒理学研究已日渐兴起，在整体性、动态性、网络调控性的内涵下，关注外来物质对机体的损伤评估与预测。药物与生物大分子作用涉及机体网络系统的巨大复杂性，使得对药物毒性作用机制的理解难度也有所增加。应用计算与实验系统生物学，药物毒理学研究在生物组织扩大到多重尺度网络分析，并由此说明治疗作用和不良反应。系统毒理学依靠实验“组学”技术，在大量可变因素中能测量多重变化，通常在全基因组水平建立网络分析药物作用。组学技术由于将个体基因组状态联系到所用药物的治疗效能和毒性反应，通常在全基因组水平建立分析药物毒性的网络系统。通路与网络分析相结合，毒理效应与毒代动力学模型，和基因多态性知识，将发展为预测毒性作用的模型。基于诸如美国食品药品管理局不良事件报告系统网络分析，可建立初步了解分子水平的药物靶点相互作用，导致器官和各级水平不良反应表型过程的远端效应。系统生物学的集成数据设计分子及相互之间作为一个网络行为，如动力学模拟，代谢调控，鲁棒性和流量分析，确实有助于理解网络介导的毒性及药物毒理学。

系统生物学;药物毒理学;生物标记物;易感个体

系统生物学是一门有关生物系统对干扰起反应的迭代和综合研究［1］。在毒理学领域，系统生物学概念被扩展为探索复杂生物过程方法而提高整体性理解的研究，如对神经系统发育中神经退行性改变的理解［2］。近年来随着高通量分子生物学技术如基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学及功能组学研究进展［3-5］，人类或动物基因组结构与功能的研究也突飞猛进，构建了大量基本数据库提供系统生物学必要的结构框图，并由此推动了药物毒理学研究迈上新的台阶。

这些数据库不断增长并成为集成模块链接在一起，提供了系统生物学所需的中间组件。将这些生物模块在适当的部位形成一个设定的机械流程方案，从而成为整合集成计算模型。对于药物毒理学而言，须将染毒的定量相关性(时效关系，量效关系)纳入计算模型。除了对直接致毒物及其致毒机制外，也要评价主要毒性效应及其表型。在系统生物学水平，可进行定量模拟并测试模型的预测性。这些迭代的结果被系统地纳入到模型，以改善模型设计并完善其预测能力。一个系统在该水平的互联性，可决定其状态并延伸到其预测能力［1］。

系统生物学的目标是利用计算模型，定向定量描述完整的机体对环境干扰所起反应，预测“组件到组件”关系的功能性结果。系统生物学方法也可用于分析染毒后出现毒理现象潜在机制的有效工具。系统生物学成功解决毒理学问题有赖于包括毒理学，分子生物学，数学，计算建模和风险评估在内的跨学科科学家通力合作。迅速发展的生物数据库，包括细胞、组织和器官模型，有必要利用强大计算系统和算法［2］。

研究接触化学物质后，可共享包括序列改变和转录变化数据库的现成资源，国际上许多大型企业和政府机构都更关注采用基因组学工具推动药物研发和安全性评估。系统生物学或称为整合传统药物毒理学方法，随着毒理基因组学，蛋白组学，代谢组学的进展，提供了新颖可靠的毒性生物标志物，可更正确地预测对人类健康造成的不良影响［6］。本文主要就毒性生物标志物发现和预测造成毒性的化合物鉴定;易感个体识别;及整合各种组学数据集，增进对生物系统毒性机制理解3个方面作一概述。

1 功能基因组学策略

基因组学涉及全基因组同时测序和多种基因表征。在DNA水平涉及基因组测序已鉴定的变化，确定转录结合位点和表观遗传学。在mRNA水平，全基因组谱分析主要集中在某一疾病状态或用药前后基因表达类型表征。该类型的分析主要通过芯片技术，也有直接mRNA序列测序。

1.1 涵盖全基因转录谱的功能基因组学

当今药物毒理学的最大挑战就是从实验数据直接预测人类风险。整体实验最常用啮齿类动物，不同种属间药物清除率、代谢酶活性和其他关键因素存在很大差异。毒理基因组学的问世可鉴定低剂量不良健康事件的基因表达类型和特征。但要做到此点，相对于仅为自身适应性生化反应变化而不是毒性而言，先要确定哪种基因表达改变和通路与将发生的病变最相关。

前沿新兴技术中，通过基因芯片技术衡量检测转录组学，以测定功能性基因或分析分子干扰。尤其是在核查蛋白组学与代谢组学时，利用目前涵盖全基因组芯片平台分析基因表达，全面了解细胞反应谱。在系统毒理学背景下，利用转录层面资料的最终结果，预测细胞损伤反应可跨越时间，剂量和物种采样，便于将风险外推到人类。

1.2 通过基因组分析提高安全性评估

通过大规模测定与确定的病理相关基因表达变化，基因芯片技术分析已成为药物毒性表征的主要组学工具。毒理基因组学的关键步骤是将“化学-诱导-表型”与基因表达变化连接的能力，称为表型锚固(phenotypic anchoring)。实验确定的基因表达特征可作为在无明显临床形态学变化时，指示未达亚临床毒性反应的生物标志物向导。为证实该法的适用性，已有报道观察到给予大鼠亚毒性剂量对乙酰氨基酚时，基因表达出现受干扰的类型［7］，由此获得尚未察觉临床肝形态学和血清生化学改变时的细微细胞损伤。而在毒性剂量，在相同基因子集表达的变化与线粒体功能障碍和氧化应激相关的更为明显，并检测到了与这些过程相关的其他基因有所改变。表明基因表达谱识别具有先于导致明显器官毒性的细胞损伤细微标志物的潜力。

1.3 毒性生物标志物鉴定

敏感生物标志物鉴定有助于检测药物治疗时毒性与疗效证据，当预测急性中毒剂量水平尚存在关键的差距时，各种组学技术可望予以解决。多种毒物，如肾毒性药物［8］，睾丸毒性药物［9］，乳头状瘤小鼠皮肤模型角质形成细胞增殖［10］的毒性基因组生物标志物近来已被确认。使用这种技术来识别安全性生物标志物的潜力巨大，并有助于创造更好的诊断工具解决传统上难以实现的毒代动力学监测，如对接受免疫抑制剂治疗的患者［11］。

调查发现大部分实验采用芯片技术研究靶器官组织或培养细胞的毒性。虽然这些实验能够深入探索药物毒性机制，但通过非侵入性手段仅可为患者群体提供有限的药物安全性监测信息。为解决该局限性，用外周血中基因表达特征作为服用各种剂量对乙酰氨基酚后肝病变早期指标［12］。基于向非损伤剂量水平加权分类和模式预算法，区别亚毒性和毒性剂量。表征对乙酰氨基酚引起的肝损伤，来自血样基因表达谱比临床生化、血液学和组织病理学更好地预测急性毒性，表明来自血中的转录谱对特定器官毒性可能是更具代表性的标志。近有报道认为，在抗癫痫药临床前研发过程中，采用生物标志物可望提高成药性降低风险性［13］。也有报道认为小鼠胚胎干细胞可作为新的测试系统，发育过程的mRNA标记可作为预测和评估药物神经发育毒性的生物标志物［14-15］。

1.4 芯片技术促进了高通量化学毒性实验

芯片技术还促进了对化学品潜在毒性高通量筛选。增强测定特定类化学品或体内外毒性反应关联的分子特征性“指纹图谱”灵敏度，加上丰富的数据输出，为筛查潜在的不良反应带来希望。此外已开发的方法不依赖公认参考化合物特征表达谱的先验知识，而是从新参考芯片转录谱评估化合物所致肝损伤［16］。一项为期2年的检测化合物对啮齿动物潜在致癌性生物测定，显示基因表达谱比常用的毒性评价终点有更好的预测能力［17］。

为验证该技术作为工具可用于化合物毒性分类，通常采用体内实验法按现行的界定器官毒性，推测引起类似病变或疾病的毒物可引起共同的基因表达变化格局。近来基于基因表达特征预测毒性，已成功区分非遗传毒性和遗传毒性致癌肝毒物［18］，肾和肝毒物［19］，并能区分由巨噬细胞活化，过氧化物酶增殖，或氧化应激［20］引起的肝毒性。

肝组织切片比培养细胞更适用于基于系统生物学的药物毒性研究，切片保持了组织内不同细胞的相对位置，因而也保持了细胞间通讯。肝组织非实质细胞对不同的化学品具有介导毒性效应作用，如乙醇、环己酰胺、硫代乙酰胺和对乙酰氨基酚［21-25］。采用大鼠肝切片原位实验，观察到与芯片资料预测的对乙酰氨基酚、脂多糖和四氯化碳的毒性及病理，这些结果与整体实验非常吻合，但如对人类肝切片实验，应加强风险评估。

1.5 通路分析有助于确定作用模式

连接基因表达谱与导致类似表型毒物分类的主要知识差距在于缺乏复杂细胞信号通路完整信息。因此，正确地识别基因-基因相互作用和调节，对确定治疗进展和干预过程可能作为潜在靶标的已知通路是必要的。转录通路层面分析亚临床病理分子干扰是必不可少的，因基因表达改变相对于临床观察的毒性是较敏感的终点。

有几个可用的有助于诠释和理解细胞过程、功能和通路基因表达的公共数据库［2］。虽然这些统计技术方法有所不同，每个都旨在归属基因表达的生物学意义。一个受各种各样外来物影响的多条通路广泛理解，对未来药物安全性评估是必不可少的。对体内出现的毒性病理学分子干预的全面理解，能有助于从高剂量到低剂量实验的转换，当相同的分子通路受影响时，能从体外资料更好地预测病理。

2 结构基因组学

2.1 识别敏感个体

遗传毒理学是一门研究基因序列变异可能影响个体毒性易感性的学科。药学领域旨在确定用药人群中易感个体，以达到药物治疗个体化并提高药物安全性［24，26］。遗传变异影响药物反应，近年来已有报道单基因毒性遗传学性状。这样的研究已在遗传等位基因鉴定预测药物毒性获得成功。如载脂蛋白E-4/4等位基因携带者，对传统的阿尔茨海默病治疗效果最不理想［27］。

随着许多生物序列确定，很明显在单一物种甚至染色体对之间，存在个体DNA序列中位置变化。这种变化称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)［24］。有时SNP落在基因编码区，导致蛋白质初级序列和活性变化。虽然编码区SNP较罕见，但对药物作用很重要，因为一些药物代谢酶的基因有编码区SNP，如华法林剂量在细胞色素P4502C9(CYP4502C9*2)的rs1799853［24，28］。因此集中于基因组测序法的基因组学分析在理解药物毒性作用中非常重要。结合分析实验模式匹配软件，已经有了药物干预后基因表达特征数据库。

目前的基因测试包括基于巯嘌呤S-转甲基酶基因型调节6-巯嘌呤剂量［29-30］;基于维生素K环氧化酶还原酶复合物(VKORC1)［31］和CYP2C9［24，28］调节华法林剂量。在VKORC1单体型分析和CYP2C9基因型组合，估计分别为25%和6%～10%在华法林剂量的差异［32］。事实上，华法林代表了第一个毒性遗传学信息(通过VKORC1单体型分析)的药物［33］，比药代动力学更好地解释了剂量变异药物基因组学(通过CYP2C9基因型)［34］。因此华法林的资料代表了一种从单基因毒性遗传学测试多基因模型的转变。

由于个体中碱基对序列变异平均为1/500～1/1000［26］，预计上述例子遇到的频率将会越来越高，涉及到较多的药物。有理由相信许多基因具有多态性，并与疾病发生相关，也在药物不良反应发生中占有重要地位。现行研究大多侧重于表型/疾病和SNP间关系［6，24］。SNP是作为药物不良反应生物标志物有前景的选择，因为不像与毒性表型相关的其他因素，如年龄，并发症和环境那样，个人的遗传密码终生稳定。基因检测提供了许多药物根据初始剂量给药后的疗效及不良反应信息，具有取代经验调整剂量的潜力。此外，预测性基因测试在药物研发过程也很有价值，用于抢救通过临床第Ⅲ期试验期间，由于一部分人群出现毒性而失败的药品［35］。一个重要的例子是遗传测试用处方药阿卡巴韦的HIV患者，筛选这些患者主要组织相容性复合体Ⅰ类，B组的(HLA-B)*5701降低了过敏反应风险［36］。

2.2 毒理遗传学与方法

在许多领域都有一些关于SNP和毒性表型具有显著相关的报道，但很少有被论证的，还往往有推翻原先结论的报道。在基因型和表型间不符合的原因有许多，多半是样本过小、等位基因人口分层和表型分类不均一所致［37-38］。为了更好地促进毒性遗传资料的临床转化，需要高效可行的策略。临床资料已用于确定复杂性状的遗传基础，如帕金森病发病［39］和HIV易感性［40］。该领域的经典方法都集中在影响一个特定表型的基因组内，映射定量特性基因座性状位点(quantitative trait loci，QTL)。虽然有许多方法来确定QTL，所有都设计一个可衡量表型个体的人群，一个基因型差异存在该人群内的数据库，连接一个特定的基因或多态性和表型重要性的统计措施［41］。经典的方法常采用存在于F2或回交鼠种群基因型和表型多样性，但该方法受在群体的所有个体必要的基因型的限制。由于重组事件在F2和回交种群数量较少，确定精确的QTL位置通常更困难。重组自交系提供固定基因组的优势，但这个系的获取和维护很昂贵。

一个有前途的新替代法是经典的基因组关联映射近交系小鼠，利用科学家和爱好者出现自然跨越几十年的杂交和近亲繁殖的近交系小鼠遗传变异的优势。在该方法中，15个近交系小鼠品系几十株大SNP数据集和超过8万个SNP的数据库已公开可用。这种新替代法的计算方法已有描述［41-42］。

应用基因组关联算法到毒理遗传法已在近交系小鼠品系体内实施，以确定影响华法林代谢的其他遗传因素［43］。该项实验中华法林的代谢，尤其是7-羟基-华法林产生在近交系非常不一致，于是该表型被计算小鼠相关的编码Cyp2c29酶基因组区域，缩小潜在基因组候选者排名实验验证，Cyp2c29多态性代表了这种酶在肝蛋白的表达［44］。进一步研究表明，利用该法相同的组用于体外生物转化体系，该体系研究了跨越15个小鼠系的下游睾酮和伊立替康代谢基因组关联性。结果显示Cyp2c29内和Ugt1a基因位点的遗传变异，分别影响了α-羟睾酮和伊立替康葡萄糖醛酸代谢［44］。但类似的研究尚有待于在人类群体中转化应用。

仅关注在排名前几位“最显著的”SNP的全基因组研究具有局限性，可通过基于通路研究加以克服。有人提出了有效检测发病因果关系机制的方法，该方法由于多种因素综合考虑，相比于仅关注数个SNP获取最高综合分而显得更有用［45］。该法结合了全基因组关联的基因组富集算法，确定可伴有多条通路与帕金森病和涉及年龄的黄斑变性相关［46］。

3 组学技术间数据集成

需要更好地论述生物系统导致系统毒理学的研究。系统毒理学包括将遗传学，毒理基因组学和常规毒性终点整合为一种系统生物学的方法。这些综合方法常用小鼠模型完善毒性通路表征，发现染毒与后果的新分子与细胞指标，更好的剂量反应评估，为更准确的个体间/跨物种间推断。虽然基于芯片的毒性研究产生了丰富的基因表达数据和受治疗影响或特定表型关联的通路，但这些数据最常见的描述并不能反映蛋白层面的变化［24］。单靠毒性基因组学数据分析的关键性限制常不能考虑混杂因素，如受试药物的药代动力学，环境因素等，肠道菌群人口等。因此比高通量代谢物或蛋白分析更全面的基因组学，不能表征全套细胞蛋白翻译后修饰和相应的调控。为解决该问题并开发更多的毒性标志物，代谢组学和蛋白组学方法已日益普及［45］(图1)，其中代谢组学数据因其相对易行且可解释而更为常用。

图1 系统生物学用于药物毒理学风险评估示意图.圆圈内的实验方法/测量代表收集方法的资料，网络、生物指标和生物标志物代表从模式生物或体外实验输出资料，可作为人类药物毒理学风险评估用。目的在于减少从整体动物获得数据作为网络信息数据库，并从体外分析直观提供至关重要的关键事件参数。

正交组学数据集大致可分为以下两大类集成法，其一是来自生物学的策略，其二是来自数据的策略［47］。生物学解释往往受假说驱动，利用上下文理解什么是已知的毒性机制。生物学驱动策略的例子为一项研究，该研究集成代谢与基因表达数据，识别人类神经内分泌(neuroendocrine，NE)癌症敏感生物标志物［48］。该项研究收集来自整体小鼠NE肿瘤、小鼠NE肿瘤培养细胞和人类原代培养NE肿瘤细胞的芯片和代谢物数据，从基因转录关键数据改变的代谢途径辨认并经质谱确定。

数据驱动的策略由主成分分析、自动组织映射和基于回归偏最小二乘分析等非监督方法，该方法已用于肝代谢［49］、抗炎药对巨噬细胞特定作用［50］、苷和花青素生物合成中调控代谢与基因转录确定［51］。另一项综合的例子是药物代谢物方法，对大鼠服用对乙酰氨基酚的前剂量尿液代谢物谱和化学计量法测量预测毒性反应［52］。当基因组、蛋白组和代谢组方法单用时，由于自身能力在描述生物系统的非线性和复杂性时受到很大限制。目前正在开发数据库和方法，利用将数据类型和独立基因组学放置更大的生物视角间的协同，这些数据库已有发表［53］。

4 展望

毒理基因组学为毒理风险评估提供了极大的希望，组学可望改变化学安全监测，改善临床干预。尤其是小干扰RNA等新兴技术的问世，许多“原理-证据”研究证明，利用毒理基因组学可预测不良反应事件和有害表型。即便如此毒理基因组学尚不能取代传统的毒理实验规范。它的兴起有利于发现新的生物标志物和发生于亚临床或易感伤害事件的轻微变化。组学技术将成为越来越不能或缺的毒性研究手段，因此设计并解释毒理基因组学和毒理遗传学结果显得尤为重要。由于多年来对复杂生物学有限的认识落后于各种物种间许多毒性类型，充分发挥潜力的组学数据集成尚需时间。发展实验工具收集数据已有较大进展，在数据分析和经基于通路技术的诠释，以及鉴定基因表达、SNP，其他细胞大分子和表型之间复杂的相互作用，也获得了一些进展。重点应放在寻找最佳方法对多重数据类型一起整合与解释，以充分表征药物引起的分子干扰。

研发预测药物毒性的生物标记物是近年来美国食品与药品管理局在基于系统生物学预测药物致人类毒性的重点举措，已提高临床前和上市后药品毒性的预测性评估［6］，早在2005年就发布了相关指南。

组学资料在人与啮齿类细胞高通量筛选上使用也有待提高，现行的动物实验费用昂贵，效率低，常使用远高于推荐人用剂量。由于种属间的差异，以及整体实验结果远不能以体外筛选代替，而基因组学工具将增加体外试验在风险评估中的价值。非常详细的基因注释仅适用于有限哺乳动物物种，如人与小鼠，但在其他物种如大鼠却相对缺乏。完整的基因信息可用性在跨模型体系、物种间理解并最终将毒性风险外推到人极为关键，如最近兴起普及的斑马鱼作为模式动物，在基于系统生物学的药物毒理学研究领域可望获得较大的应用前景［54-55］。

正在到来的基因组学和遗传学研究浪潮是个性化毒性预测，及为特定患者调整药物治疗的能力。该领域因方便易行，廉价的个别全基因组基因分型而极大发展。为将结构基因组学资料用于药物开发和临床安全性实验，需精心设计啮齿类模型用以适当人口为基础的模型。连接啮齿类与人类毒性的转化研究将成为该领域成功的关键，加强学科间交叉研究与团队合作可望推动基于系统生物学的药物毒理学快速发展。

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Research progress in drug toxicology based on systems biology

LOU Yi-jia
(Institute of Pharmacology，Toxicology，and Biochemical Pharmaceutics，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China)

The research of toxicology based on systems biology has come into vogue.Systems toxicology analyses rely on experimental'omics'technologies that are capable of measuring changes in large numbers of variables，often at a genome-wide level，to build networks for analyzing drug toxic action.A major use of'omics'technologies is to relate the genomic status of an individual to the therapeutic efficacy of a drug of interest.Combining pathway and network analyses，toxicokinetic and toxicodynamic models，and a knowledge of polymorphisms in the genome will enable the development of predictive models of therapeutic toxic efficacy.Network analyses based on publicly available databases such as the U.S.Food and Drug Administration's Adverse Event Reporting System allow us to develop an initial understanding of the context within which molecular-level drug-target interactions can lead to distal effectors in a process that results in adverse phenotypes at the organ and organism levels.This review focuses on recent advancements in the application of genomic and genetic data to drug safety and highlights recent successes and current knowledge gaps in the following areas:①the discovery of toxicity biomarkers and identification of compounds that are predicted to cause toxicity，②the identification of susceptible individuals，and③integration of various'omics'datasets to improve understanding of toxicity mechanisms within a biological system.

system biology;drug toxicology;biomarkers;susceptible individuals

The project supported by National Natural Science Foundation of China((81173135);National Natural Science Foundation of China(30973600);Provincial Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LZ12H31001)

LOU Yi-jia，E-mail:yijialou@cps.zju.edu.cn

R992

A

1000-3002(2012)04-0476-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.002

国家自然科学基金资助项目(81173135);国家自然科学基金资助项目(30973600);浙江省自然科学基金重点资助项目(LZ12H31001)

楼宜嘉，E-mail:yijialou@cps.zju.edu.cn

2012-07-08)

(本文编辑:乔虹)