非接触式共培养体外血脑屏障模型的跨膜电阻及通透性

张水华，季龙凤，马璟

(1.福建医科大学福建省新药安全性评价中心，福建福州350108;2.国家上海新药安全性评价研究中心，上海201203)

非接触式共培养体外血脑屏障模型的跨膜电阻及通透性

张水华1，2，季龙凤2，马璟2

(1.福建医科大学福建省新药安全性评价中心，福建福州350108;2.国家上海新药安全性评价研究中心，上海201203)

目的建立大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCEC)与星形胶质细胞共培养血脑屏障模型并评价其功能。方法采用SD大鼠原代分离培养获得BCEC和星形胶质细胞。经细胞形态学观察、免疫组化检测相关抗原后建立非接触式共培养血脑屏障模型，测定共培养模型所形成的跨细胞电阻及荧光素钠的通透性。采用LC-MS检测6个化合物透过血脑屏障模型的通透性，并与文献报道的体内数据进行比较。结果培养的BCEC多数为短梭形外观，免疫组化检测可见细胞高表达因子Ⅷ;星形胶质细胞呈现具有细胞突起的典型形态，免疫组化检测可见细胞高表达胶质纤维酸性蛋白。共培养的体外血脑屏障模型跨BCEC单层的电阻值为(373±41)Ω·cm2，荧光素钠跨BCEC单层的通透性为(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，符合体外血脑屏障模型要求。对所选6个化合物体内外透过BBB模型渗透系数的比较，表明具有一定的相关性(R2=0.7679，P＜0.05)。结论建立的体外BBB模型在跨内皮电阻和通透性方面具备了在体BBB的基本特性，可以用于模拟体内环境，进行药物早期筛选方面的研究。

毛细血管内皮细胞，脑;星形胶质细胞;血脑屏障

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是脑屏障的重要组成部分，它能阻止血流中的大多数物质进入中枢神经系统，在维持中枢神经系统内环境的稳定中起着十分重要的作用。在药物的研发过程中，研究药物对BBB的作用及其机制具有重要意义，但由于其结构复杂，许多研究者通过建立体外BBB模型来研究药物的作用机制［1］。BBB主要由脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells，BCEC)、星形胶质细胞足突、周细胞和基底膜组成，其中BCEC是构成BBB的结构基础，所以，获得高纯度的BCEC成为建立BBB的关键因素。研究发现，单独培养的BCEC会逐渐丧失BBB特性，在培养体系中加入星形胶质细胞后能够较好地模拟体内环境，可以较好地保留BBB特性，因此，BBB模型由早期的单层BCEC培养逐渐向与星形胶质细胞共培养过渡［2－3］。理想的体外模型不但要具有BBB的特征，而且要有使用简单、重复性好、经济有效及能够进行中、高通量筛选等特点，但目前所有模型都不能同时满足上述特点［4］。通常采用细胞形态及其屏障功能等评价体外BBB模型，但其与体内的相关性少有报道。本研究在建立模型的基础上，选择一系列化合物，初步测定其透过BBB模型的通透性并计算其相关性，以便进一步评价模型的可靠性。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

DMEM高糖培养基(美国Gibco公司);脱氧核糖核酸酶Ⅰ(美国Sigma公司);牛血清白蛋白(瑞士Roche公司);Ⅰ型鼠尾胶原蛋白(杭州生友生物技术有限公司);Ⅱ型胶原酶(美国Invitrogen公司);西咪替丁(cimetidine)、安替比林(antipyrine)、秋水仙碱(colchicine)、水杨酸(salicylic acid)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氢化可的松(hydrocortisone)和荧光素钠，均购自美国Sigma公司;碱性成纤维生长因子(英国PeproTech公司);嘌罗霉素(puromycin，美国Amresco公司);因子Ⅷ和胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫组化试剂盒(丹麦DAKO公司);1200-API4000型液质联用仪(美国安捷伦公司);MERS00001型Millicell-ERS跨内皮阻抗测试仪(美国Millipore公司);Gemini EM荧光酶标仪(美国Molecular Devices公司);Transwell 3460细胞培养池(美国Corning公司)。

1.2 大鼠BCEC的分离和培养

取2周龄左右SD大鼠，脱臼处死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min，无菌条件下取出大脑，置于盛有预冷的PBS培养皿中，解剖显微镜下分离脑组织，取出大脑皮质，在无菌纱布上滚动粘去脑膜和大血管，再在解剖显微镜下剔除残余的脑膜和大血管，用剪刀剪碎大脑皮质成1 mm3大小糊状，加入0.1%Ⅱ型胶原酶，置于CO2培养箱中消化1.5 h，1000×g下离心5 min，弃上清，将沉淀加入配制好的20%BSA溶液中混匀后，4℃，1000×g下离心20 min，保留底部沉淀，将淡红色部分接种于预先铺有Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的6孔板中，20%FBS，每孔2 ml。次日换液并加入含有碱性成纤维生长因子10 μg·L－1、嘌罗霉素［5］3 mg·L－1、氢化可的松500 μg·L－1的培养基2 ml，3 d后换液，去除嘌罗霉素继续培养，直至细胞长满为止，鉴定。

1.3 星型胶质细胞的分离与培养

取1～3 d龄SD大鼠，脱臼处死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min，无菌条件下取出大脑，置于盛有预冷的PBS培养皿中，解剖显微镜下分离脑组织，取出大脑皮质，在无菌纱布上滚动粘去脑膜和大血管，再在解剖显微镜下剔除残余的脑膜和大血管，用剪刀剪碎大脑皮质成1 mm3大小糊状，加入8 ml含有0.125%胰蛋白酶和DNA酶30 kU·L－1的PBS，37℃消化15 min，1000×g下离心3 min，弃上清。将沉淀转移至玻璃离心管中，加入培养基后，反复轻轻吹打，收集已吹散成单个细胞的上层悬液，重复3～4次，将细胞密度调整为1×109L－1左右，加入到包被好的25 cm2塑料培养瓶中。每3 d换液1次，培养9～10 d，密封好瓶口，37℃，置于摇床中以250 rpm·min－1，摇动12 h，倾去摇下来的细胞，剩余的贴壁细胞胰酶消化，1∶3传代至新的鼠尾胶原包被的25 cm2塑料培养瓶［6］。

1.4 细胞鉴定

细胞培养板中取出长满BCEC(或星形胶质细胞)的盖玻片，4%多聚甲醛室温固定20 min，3%过氧化氢室温处理10 min，10%正常羊血清37℃封闭30 min，分别加入兔抗人因子Ⅷ(或GFAP)一抗和羊抗兔二抗(1∶100)各1 h，再依次DAB染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明和中性树脂封片。

1.5 BBB模型的建立

采用Corning公司Transwell 3460细胞培养池(PET膜材，孔径0.4 μm)作为共培养的支持物建立大鼠BCEC与星形胶质细胞非接触式共培养模型，首先将分离的脑毛细血管段接种于包被好的细胞培养池的上室，培养3 d后，去除嘌呤霉素，将细胞培养池置于底部含有星形胶质细胞的12孔板内，7 d后BCEC即可形成致密单层。

1.6 BBB模型的评价

1.6.1 跨内皮细胞电阻的测定

通过测定模型中跨BCEC的电阻值评价体外BBB模型中细胞旁转运程度。用Millicell ERS测定共培养模型的跨内皮细胞电阻值(transendothelial electric resistance，TEER)为内皮细胞(endothelial cell，EC)与滤过层TEER之和，以无细胞的培养池作为对照，测得其电阻值为滤过层的TEER，则单层BCEC的电阻值为:TEEREC=(TEEREC+filter－TEERfilter)×S(膜面积)，单位为:Ω·cm2。

1.6.2 荧光素钠通透性的测定

通过荧光酶标仪测定荧光素钠0.004，0.02，0.1，0.5和1 mg·L－1的荧光强度，每个样品测定3次，取平均值绘制荧光素钠标准曲线，再根据文献报道的方法［7－8］，测定并计算荧光素钠体外透过BCEC单层的量。首先在接受池中加入1.5 ml Hanks液，在供给池中加入0.5 ml含有荧光素钠10 mg·L－1的Hanks液，于1 h后从接受池中取100 μl溶液，测定荧光强度，再通过荧光素钠标准曲线，计算荧光素钠透过BBB模型及无细胞对照组的量。再根据公式清除体积(μl)=(cA×VA)/cL计算清除体积。cA为接受池浓度;VA为接受池体积;cL为供给池初浓度。

通过以清除体积对时间作图，其斜率表示清除率(μl·min－1)，记作相应的通透性(P)×表面积(S)。荧光素钠体外透过BCEC单层的通透性×表面积(PSe)可由以下公式计算得到:1/PSe=1/PSt－1/PSf，其中PSt表示BBB的通透性×表面积，PSf表示无细胞的培养池对照组的通透性×表面积，S为细胞培养池的膜面积，本实验的S为1.12 cm2。

1.7 应用建立的模型检测已知化合物的通透性

初步选择具有不同转运机制的化合物，如西咪替丁、秋水仙碱、氢化可的松、甲苯磺丁脲是主动外排的底物;水杨酸是主动吸收的底物;安替比林是被动扩散方式吸收，研究这些化合物在BBB模型中的通透性，并与文献报道的体内数据［9－10］进行比较，探讨其间的相关性，以进一步验证模型的可靠性。根据1.6.2中的方法，计算各化合物在体外BBB模型中的通透性。待各孔的电阻值达到300 Ω·cm2后，在接受池中加入1.5 ml Hanks液，在供给池中加入0.5 ml含有约20 mg·L－1药物的Hanks液，1 h后从接受池中取一定量的溶液，低温保存待测，并计算透过单层BCEC的量。

2 结果

2.1 培养的大鼠BCEC鉴定

接种初期可见由内皮细胞构成的呈枝状的脑毛细血管段和零散的细胞(图1A);培养1 d后可见培养的细胞从贴壁的血管段周围长出，细胞呈梭形(图1B);随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，细胞呈铺路石状，6 d左右细胞达到融合(图1C)。因子Ⅷ相关抗原是BCEC特征性蛋白，因此，免疫组化检测因子Ⅷ可用来鉴定细胞的纯度。实验结果表明，培养的BCEC的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构(图2A);未加一抗的对照组染色为阴性(图2B)。细胞纯度达95%以上。

Fig.1 Cell morphology of rat brain capillary endothelial cells(BCEC)under light microscope(×100).A:0 d after seeding;B:1 d after seeding;C:6 d after seeding.

Fig.2 Purification detection of BCEC by immunohistochemistry(DAB×100).A:the cells were cultured with rabbit anti-human factor Ⅷ IgG as the first antibody and goat antirabbit IgG as the second antibody;B:control group cells treated without antibodies.

2.2 培养的大鼠星形胶质细胞鉴定

星形胶质细胞在原代培养后的9～10 d，细胞达到融合状态，细胞出现分层，位于下层的星形胶质细胞成簇生长，小胶质细胞和少突胶质细胞位于上层生长，通过摇床可有效地将两层细胞分离。采用这种分离方法得到的星形胶质细胞纯度比较高，细胞胞体呈圆形，具有分支状突起(图3);胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特征性蛋白，因此免疫组化检测胶质纤维酸性蛋白可用来鉴定细胞的纯度。实验结果表明，培养的星形胶质细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，细胞纯度达95%以上，未加一抗的对照组染色为阴性(图4)。

Fig.3 Cell morphology of rat astrocytes under light microscope(×100).

Fig.4 Purificaton detection of rat astrocytes by immunohistochemistry(DAB×100).A:the cells were cultured with glial fibrillary acidic protein as first antibody and goat anti-rabbit IgG as the second antibody;B:control group cells treated without antibodies.

2.3 BBB模型跨内皮细胞电阻值

通过测定BCEC两侧的电阻可以评价紧密连接形成的程度。由于不同动物来源的内皮细胞或细胞株、模型共培养的方法以及其他实验条件的差异，文献报道的共培养模型所形成的跨细胞电阻值不尽相同。但大多数结果表明，跨细胞单层电阻值应该在300 Ω·cm2以上［11］，本实验共培养模型的电阻值为(373±41)Ω·cm2，符合体外BBB模型的要求。

2.4 BBB模型荧光素钠通透性

从荧光素钠标准曲线(图5)中可以看出，荧光素钠浓度与其荧光强度相关性较好，可以通过荧光强度的量来反映溶液中荧光素钠的浓度。本实验以荧光素钠在BBB模型中的清除体积对时间作图(图6)，其中y=0.3175x表示荧光素钠透过BBB模型的体积与时间的关系，清除体积=(19.05±7.24)μl;y=1.9725x表示无细胞的对照组，清除体积=(118±31)μl，通过公式1/PSe=1/PSt–1/PSf即可计算出荧光素钠跨BCEC单层的渗透系数为(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，与文献［12］报道的范围相近。

Fig.5 Standard curve of fluorescein sodium.

Fig.7 Clearance of fluorescein sodium across in vitro blood brain barrier(BBB)model(○)or across a filter coated with collagen(●).

2.5 化合物在建立的BBB模型上的通透性

为了评价体外BBB模型在预测化合物体内BBB渗透性的能力，本研究选择6个已有文献报道体内BBB渗透性的化合物，测定其体外通透性。图7结果表明，具有被动扩散的化合物安替比林具有最高的通透性，而主动吸收的水杨酸及主动外排的西咪替丁具有较低的通透性，相关性分析表明P=0.022。

Fig.7Correlation of compounds between in vitro and in vivo.BBB:blood brain barrier.

3 讨论

目前分离培养BCEC的动物主要有牛、猪、大鼠和小鼠等。一般认为牛、猪等大动物来源的BCEC更适合建立体外BBB，但由于牛、猪等动物取材不易，故很多实验室采用鼠，尤其是大鼠作为分离材料。但大鼠来源的BCEC在体外传代效果差，且容易失去原有内皮细胞的特性。为了使分离的BCEC在体外保持原有内皮细胞特性，我们采用原代的大鼠来源的BCEC建立体外BBB，取得了较好的效果。BCEC的培养关键是细胞的纯化，纯化方法有通过免疫磁珠纯化、Percoll离心纯化［13－14］等，这些方法较为繁琐，增加了分离的时间，也有可能影响细胞的活性。参考文献［3］，在分离得到血管段后，省去Percoll离心等步骤，在培液中加入一定浓度的P-gp底物嘌罗霉素，结果表明嘌罗霉素可以起到很好地纯化BCEC的作用，细胞纯度达到95%以上。

星形胶质细胞的分离与培养相对较为简单，但其可能被小胶质细胞和少突胶质细胞污染。McCarthy等［6］的研究表明，在原代培养星形胶质细胞培养7～9 d后将培养瓶置于水平摇床，于250 rpm·min－1，37℃条件下摇动15～18 h，使生长在星形胶质细胞上的少突胶质细胞和其他细胞脱离，通过换液弃去悬浮的杂细胞后，将仍附着于培养瓶的细胞用于培养，即可获得纯度95%以上的星形胶质细胞。

BBB模型的建立一般采用BCEC与星形胶质细胞共培养的方式，基于胶质细胞在培养体系位置的不同可以分为以下2种:①接触式共培养，即BCEC与胶质细胞共培养于细胞培养池两侧，上侧接种内皮细胞，下侧接种胶质细胞，细胞间可以紧密接触。②非接触式共培养，即内皮细胞接种于细胞培养池的上侧，胶质细胞接种于培养板的底部，细胞间虽然不能够相互接触，但细胞间物质可以自由交换。至于哪一种方法更好，目前还存在一些争议。有研究表明，非接触式共培养与体内结果有很好的相关性，而接触式共培养产生更强的限制性屏障。一般来说，接触式共培养可以用于BBB功能的研究，而非接触式共培养可以用于物质通透性研究。其他模型，如3种细胞共培养模型或动态共培养模型等，它们可能更接近体内的真实状态，但相对较为繁琐，难以广泛应用［15］。由于本研究主要侧重于研究不同化合物的通透性，因此，建立的是非接触式共培养模型。通过形态学和免疫组织化学对BCEC和星形胶质细胞的鉴定，表明符合建立BBB的基本细胞要求。通过测定BCEC单层细胞的电阻和荧光素钠的通透性结果表明，建立的非接触式体外BBB模型符合体外BBB模型的要求。尽管体外建立的BBB模型具有体内的某些特点，但体外模型是否能够预测体内的情况，关键是看其相关性如何。因此，本研究测定了6个具有不同物化性质的化合物在体外模型中的通透性，并与相应的体内数据比较，结果表明两者具有一定的相关性(R2=0.7679)。

总之，本研究建立的BBB模型较好地反映了体内的情况，可以用于模拟体内环境，进行药物早期筛选方面的研究。但由于本研究评价指标的选择、化合物数量及性质的局限性，本方法还需进一步的验证和完善。

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Transendothelial electric resistance and permeability of in vitro model of no-contact co-culture blood-brain barrier

ZHANG Shui-hua1，2，JI Long-feng2，MA Jing2
(1.Fujian Center for Safety Evaluation of New Drugs，Fujian Medical University，Fuzhou350108，China;2.National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai201203，China)

OBJECTIVETo establish and evaluate a co-culture model of blood-brain barrier(BBB)using primary rat brain capillary endothelial cells(BCEC)and astrocytes.METHODSPrimary cultures of BCEC and astrocytes were prepared from SD rats.Two kinds of cells were identified through cell morphology and immunohistochemistry.No-contact co-culture BBB model in vitro was developed and transendotheliar resistance and permeability of fluorescein sodium were measured.Additionally in vitro BBB permeabilities of six compounds were measured by LC-MS and compared their results with in vivo from literatures.RESULTSThe cultured BCEC possessed the spindle-shaped morphology and expressed factor Ⅷ antigen.The cultured astrocytes possessed cell process morphology and expressed GFAP antigen.Transendothelial electric resistance(TEER)and permeability of fluorescein sodium were(373±41)Ω·cm2and(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，respectively.These values were consistent with literatures.The correlation(R2=0.7679，P＜0.05)between in vitro permeability of selected six compounds and the in vivo published data was calculated.CONCLUSIONTEER and permeability of in vitro BBB model have similar properties as that of in vivo BBB model.This model can simulate environment in vivo BBB and be used for drug screening study.

capillary endothelial cells，brain;astrocytes;blood-brain barrier

The project supported by state Major Scientific Special Project for″Major New Drugs Innovation and Development″(2008ZX09305-006);Scientific Research Foundation for Doctor of Fujian Medical University(2011BS5002);Fujian Province Government Special Fund(Min Fa Gai High-tech 2009-648)

Ma Jing，E-mail:jma@ncdser.com

R963

A

1000-3002(2012)06-0882-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.018

国家“重大新药创制”科技重大专项(2008ZX09305-006);福建医科大学博士科研启动基金(2011BS002);福建省政府专项基金(闽发改高技2009-648)

张水华(1977－)，男，博士，主要从事药物毒理学研究。

马璟，E-mail:jma@ncdser.com

2012-03-22接受日期:2102-09-15)

(本文编辑:乔虹)