黄皮果提取物对急性乙醇中毒致小鼠肝损伤的保护作用

官堂明，刘德承，王珺飞，蔡珊，林美金，卢瑞荣，吴科锋，马晓鹂，吴铁，李文德，

(广东医学院1.药理学教研室，2.第一临床学院2008级本科，3.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023;4.附属医院药学部，广东湛江524001)

黄皮果提取物对急性乙醇中毒致小鼠肝损伤的保护作用

官堂明1，刘德承1，王珺飞1，蔡珊2，林美金2，卢瑞荣2，吴科锋3，马晓鹂4，吴铁1，李文德1，3

(广东医学院1.药理学教研室，2.第一临床学院2008级本科，3.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023;4.附属医院药学部，广东湛江524001)

目的探讨黄皮果提取物(EFCL)对小鼠急性乙醇中毒致肝损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法ICR小鼠40只，随机分为正常对照、模型及EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组。EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠分别ig给予相应剂量的EFCL;30 min后ig给予52℃二锅头白酒12 ml·kg－1;24 h后处死小鼠，制备血清，取肝组织制备10%肝组织匀浆，采用试剂盒方法检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性，以及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量，常规HE染色和淀粉酶-过碘酸希夫法染色观察肝组织病理形态改变，并用免疫组织化学法测定肝组织中NF-κB和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清ALT和AST活性分别升高28.0%和28.9%(P＜0.01)，肝组织匀浆中SOD活性和GSH含量分别由(706±46)kU·g－1蛋白和(251±61)mg·g－1蛋白降低至(515±68)kU·g－1蛋白和(126±18)mg·g－1蛋白，而MDA含量由(204±21)μmol·g－1蛋白升高至(258±50)μmol·g－1蛋白(P＜0.05);肝组织中NF-κB和α-SMA表达增加(P＜0.01)。与模型对照组比较，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠血清ALT活性分别降低了18.3%和19.8%，血清中AST活性分别降低了6.4%和9.7%(P＜0.05，P＜0.01);EFCL 3.0 g·kg－1组肝组织匀浆中GSH水平和SOD活性分别升高了61.4%和14.8%(P＜0.05，P＜0.01)。肝组织中NF-κB和α-SMA的表达水平明显低于模型对照组(P＜0.01)。肝组织病理形态检测可见，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠对乙醇引起的肝细胞脂肪样变、水样变和炎症细胞浸润等均有明显改善。结论EFCL对小鼠急性乙醇中毒所致肝损伤具有保护作用，其机制可能与升高抗氧化酶活性、促进自由基清除、降低NF-κB的表达及抑制肝星状细胞活化有关。

黄皮果;乙醇;肝损伤;抗氧化;NF-κB;α-平滑肌肌动蛋白

急性乙醇中毒又称醉酒，是指短时间内饮入过量的乙醇或乙醇饮料后所引起的中枢神经系统兴奋及随后的抑制状态。目前，过量饮酒和酗酒的现象日益增多，乙醇性肝病发病率也逐年升高［1］。因此，开发对急性乙醇性肝损伤，尤其是对暴发型乙醇性肝损伤具有保护作用的药物意义重大。黄皮果为芸香科黄皮属黄皮〔Clausena lansium(Lour.)Skeels〕的果实，具有健脾开胃和行气解郁之功效，现代药理学研究结果表明，其中的有效成分黄皮酰胺(clausenamide)具有保肝、促智和抗神经细胞凋亡等作用［2－6］。本研究以急性乙醇中毒小鼠为模型，观察黄皮果提取物〔extracts from fruit of C.lansium(Lour.)Skeels，EFCL〕对急性乙醇性肝损伤的保护作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

健康ICR种小鼠，雌雄各半，体质量24～28 g，均为清洁级动物，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号:SCXK(湘)2011-0003。52℃二锅头白酒为北京红星酒业有限公司产品;Folin-酚试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransaminase，AST)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定试剂盒，丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量测定试剂盒和糖原染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所;NF-κB抗体、DAB显色剂和SABC试剂盒均购自北京中杉金桥公司;小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司。752N紫外可见分光光度计，上海精科实业有限公司;T-500型电子天平，常熟双杰测试仪器;台式离心机，上海安亭科学仪器公司;DZF-6090真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;BIO-TEX ELX800酶标仪，购自北京中杉金桥公司。

1.2 黄皮果提取物的制备

黄皮果购自湛江市益寿堂药店，产地广东郁南。称取黄皮果干品适量，粉碎，过60目筛，备用。准确称取样品500 g，90℃水煎3次，每次2 h，过滤，合并滤液，真空干燥得棕红色固形物即EFCL 152 g，提取率30.4%。EFCL与碘化汞钾试剂反应为阴性，提示无生物碱存在;与斐林试剂、银氨溶液反应呈阳性，表明EFCL含有可溶性还原性糖;与铁氰化钾-三氯化铁试剂反应呈阳性，与溴水反应生成白色沉淀，表明EFCL含有酚酸类物质。采用苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定EFCL中总糖含量不低于78.5%，采用Folin-酚比色法在760 nm波长处测定EFCL中总酚含量不低于2.5%。用生理盐水将EFCL配制成100 g·L－1的母液，4℃保存备用。

1.3 动物分组、给药和急性乙醇中毒模型制备

选取小鼠40只，雌雄各半，随机分成正常对照、模型和EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组，每组10只。EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠分别ig给予相应剂量的EFCL，正常和模型对照组则ig给予等体积生理盐水;30 min后正常对照组ig给予相应体积的生理盐水，其余各组分别ig给予52℃二锅头白酒12 ml·kg－1;24 h后眼球取血，处死小鼠，取肝组织备用。

1.4 血清ALT和AST活性检测

小鼠全血1006×g离心10 min，分离血清，－20℃冰箱保存，按照试剂盒说明方法检测血中ALT和AST活性。

1.5 肝组织匀浆SOD活性、MDA和GSH含量检测

取肝组织立即放在冰生理盐水中漂洗2次，滤纸吸干，取相同部位的一小块肝组织用生理盐水制备成10%的肝组织匀浆，1006×g离心10 min，分离上清液，－20℃冰箱保存，按试剂盒说明书测定肝组织SOD活性、MDA和GSH含量。

1.6 肝组织病理形态检测

取部分肝组织用10%甲醛固定36 h，石蜡包埋，切片，常规HE染色和D-PAS染色后于光学显微镜下观察肝组织病理改变;根据肝组织病变程度以半定量方法积分，并按各种病变重要性乘以不同加权数。加权数:肝细胞坏死×3，肝细胞水样变×1，淤血、出血×l，炎症细胞浸润×1。计算每只小鼠肝组织病变的总积分，进行统计学分析。

1.7 免疫组化染色测定肝组织NF-κB和α-SMA蛋白表达

肝组织石蜡包埋、切片，二甲苯透明，常规脱蜡至水，3%过氧化氢孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min，微波修复15 min;加人正常山羊血清封闭液，37℃孵育15 min，然后加入一抗(1∶100稀释)，4℃过夜，PBS洗3次，每次3 min;加入二抗，37℃孵育15 min，PBS洗3次，每次3 min;最后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC)工作液，37℃孵育15 min，PBS洗3次，每次3 min;DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗，苏木紫复染，中性树胶封片。每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。肝组织中NF-κBp65及α-SMA免疫组织化学染色图像，用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行图像分析，每张切片取5个视野测定NF-κB和α-SMA蛋白阳性反应产物的积分吸光度(integrated absorbance，IA)值，取平均值表示NF-κB和α-SMA蛋白表达水平。IA值越大表示目的蛋白表达越强。

1.8 统计学分析

实验结果数据均以x¯±s 表示，并采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，多组间比较用方差分析。方差齐性时，采用LSD检验比较;方差不齐时，采用Dunnett t检验比较。

2 结果

2.1 EFCL对急性乙醇中毒小鼠血清ALT和AST活性的影响

与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清ALT和AST活性分别升高28.0%和28.9%(P＜0.01)，表明大剂量的乙醇摄入可使肝功能受损。与模型对照组相比，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠血清ALT活性分别降低18.3%和19.8%，AST活性分别降低6.4%和9.7%，表明EFCL能明显拮抗乙醇对肝的损伤(表1)。

2.2 EFCL对急性乙醇中毒小鼠肝组织匀浆中SOD活性、MDA和GSH含量的影响

与正常对照组相比，模型组SOD活性和GSH含量明显降低，MDA含量升高(P＜0.01)，表明大剂量的乙醇摄入导致肝内抗氧化能力显著下降。与模型对照组相比，EFCL 3.0 g·kg－1组小鼠肝GSH水平和SOD活性分别升高61.4%和14.8%，EFCL 3.0 g·kg－1组小鼠肝MDA含量降低12.9%，表明EFCL能增强急性乙醇中毒小鼠肝的抗氧化能力(表2)。

Tab.1 Effect of extracts from fruit of C.lansium(Lour.)Skeels(EFCL)on activity of alanine transaminase(ALT)and aspartate aminotransaminase(AST)of mice with acute alcoholism

Tab.2 Effect of EFCL on activity of superoxide dismutase(SOD)，contents of malondialdehyde(MDA)and glutathione(GSH)in liver tissue of mice with acute alcoholism

2.3 EFCL对急性乙醇中毒小鼠肝组织病理变化的影响

正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞无明显变性、坏死，无炎症细胞浸润(图1A)。模型对照组小鼠肝可见肝小叶中央静脉和汇管区周围有大量肝细胞水样变，肝细胞脂肪样变明显，肝细胞索排列紊乱，可见炎症细胞浸润(图1B)。与模型组相比，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠肝细胞水样变、脂肪样变以及炎症细胞浸润均明显减轻(图1C，D)，其中以EFCL 3.0 g·kg－1组效果更显著。D-PAS染色结果显示，模型组小鼠肝内多处可见蜡质样细胞沉积(库普弗细胞吞噬坏死肝细胞残骸脂褐素胞体肿大)，呈品红色(图2B);而正常对照组和EFCL 3.0 g·kg－1组未发现有蜡质样细胞明显沉积(图2A，D，表3)。

Fig.1 Effect of EFCL on pathological changes in liver tissue of mice with acute alcoholism(HE×400).See Tab.1 for the mouse treatment.A:normal;B:model;C:EFCL 1.5 g·kg－1;D:model+EFCL 3.0 g·kg－1.Arrows:hydropic cells.

Tab.3 Effect of EFCL on pathological changes in liver of mice with acute alcoholism

2.4 EFCL对急性乙醇中毒小鼠肝组织NF-κB和α-SMA蛋白表达的影响

光镜下，小鼠肝组织NF-κB阳性细胞呈明显的棕黄色或深棕色，分布于细胞质和细胞核，表达强度不一，以中央静脉周围表达较多(图3A)。肝组织中α-SMA表达以肝细胞胞浆为主，着色为黄色或棕黄色，以中央静脉壁和周围血管壁表达较多(图4A)。与正常对照组比较，模型对照组中NF-κB和α-SMA表达均明显升高(P＜0.01);与模型组比较，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组NF-κB和α-SMA表达均明显减弱(P＜0.01)，其中以EFCL 3.0 g·kg－1组作用更为明显(图3和4，表4)。

Tab.4 Effect of EFCL on NF-κB and α-SMA protein expression in liver tissue of mice with acute alcoholism

3 讨论

Fig.3 Effect of EFCL on NF-κB expression in liver tissue of mice with acute alcoholism(Immunostaining×400).See Tab.1 for the mice treatment.A:normal;B:model;C:EFCL 1.5 g·kg－1;D:EFCL 3.0 g·kg－1.Arrows:NF-κB positive cells.

Fig.4 Effect of EFCL on α-smooth muscle actin(α-SMA)expression in liver tissue of mice with acute alcoholism(Immunostaining×400).See Tab.1 for the mice treatment.A:normal;B:model;C:EFCL 1.5 g·kg－1;D:EFCL 3.0 g·kg－1.Arrows:α-SMA positive cells.

乙醇进入体内后90%以上是在肝代谢，急性乙醇中毒时，乙醇直接刺激、损伤肝细胞，肝细胞发生变性、坏死，影响肝对蛋白质和脂肪的正常代谢及解毒功能［7］。本研究结果显示，灌酒24 h后，模型对照组小鼠血清ALT和AST活性显著升高，表明小鼠肝细胞已受损伤;EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠血清ALT和AST活性明显低于模型对照组，提示EFCL可减轻乙醇引起的肝损伤。

大量乙醇摄入可刺激肝细胞产生氧自由基，导致肝脂质过氧化增加，从而对肝等器官造成损伤［8］。因此，获得有效自由基清除剂及提高体内清除自由基的酶类活性物质是解酒保肝的研究重点。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量高低可反映氧自由基水平和脂质过氧化强度。GSH是一种低分子清除剂，对脂自由基及脂质过氧化自由基等具有较强的清除作用。机体氧化反应亢进时，GSH不断被消耗;而乙醇代谢产物乙醛又通过损害线粒体脂肪酸的β氧化，引起脂质过氧化反应，抑制GSH的生物合成，使非酶抗氧化物GSH含量以及抗氧化物酶SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和GSH-px的活性均显著降低，降低机体抗氧化功能［9］。本研究结果发现，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组均能提高小鼠肝组织中SOD活性，降低MDA含量，同时减少乙醇所致肝GSH耗竭，从而增强机体对自由基的清除作用，减轻乙醇对肝的脂质过氧化损伤，改善肝细胞的脂肪样变，降低脂肪在肝细胞内的沉积，维持机体正常代谢。这与HE染色和D-PAS染色观察到的结果相符。模型对照组肝细胞出现明显的脂肪样变、水样变、炎症细胞浸润以及较多的库普弗细胞在坏死带积聚，EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组均未发现有上述现象。

乙醇还可能通过肝损伤产生的炎症因子以及相关的生物活性因子刺激肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化［10－11］。HSC的活化可伴有NF-κB等转录因子的激活及c-myb基因表达的增强，而c-MYB蛋白可结合α-SMA基因调控区［12－13］表达α-SMA(α-SMA是HSC活化的主要标志物，与HSC活化的程度及数量呈正相关)。活化的HSC和NF-κB继而引发一系列级联放大反应，产生急性期蛋白、酶类、细胞因子、化学因子、黏附因子以及生长因子等，导致急性肝损伤［14－16］。本研究结果表明，乙醇使模型对照组小鼠肝组织NF-κB表达升高，激活炎症反应，使HSC活化，而活化的HSC内NF-κB表达也增高，释放多种炎症细胞因子，正反馈放大炎症反应;同时乙醇还通过激活机体内脂质过氧化反应，引起肝内GSH含量和SOD活性显著降低，进一步加重肝细胞内炎症应激反应和组织损伤。EFCL 1.5和3.0 g·kg－1组小鼠肝组织中的NF-κB和α-SMA的表达与模型对照组小鼠相比明显下降，表明EFCL保护急性乙醇中毒所致肝损伤的作用机制主要与抑制NF-κB活化、降低肝内脂质过氧化反应，从而减轻乙醇对肝细胞的损伤、避免HSC活化有关。

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Protective effect of extract from fruit of Clausena lansium(Lour.)Skeels against acute alcohol-induced hepatotoxicity in mice

GUAN Tang-ming1，LIU De-cheng1，WANG Jun-fei1，CAI Shan2，LIN Mei-jin2，LU Rui-rong2，WU Ke-feng3，MA Xiao-li4，WU Tie1，LI Wen-de1，3
(1.Department of Pharmacology，2.Grade 2008，the First Clinical Medical School，3.Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang524023，China;4.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Zhanjiang524001，China)

OBJECTIVETo study the protective effect of the extract from fruit of Clausena lansium(Lour.)Skeels(EFCL)against acute alcohol-induced hepatotoxicity in mice.METHODSThe mouse model was established to use Red Star wine，its ethanol content was 52%by volume.Forty ICR mice were divided into four groups randomly:normal，model，EFCL 1.5 and 3.0 g·kg－1groups.The mice in EFCL groups were ig given EFCL 1.5 and 3.0 g·kg－1，respectively.Thirty minutes later，wine 12 ml·kg－1was administered to mice except in normal group.The activity of alanine transaminase(ALT)and aspartate aminotransaminase(AST)was detected in serum，and the level of superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)and glutathione(GSH)was tested in the liver tissue with kits 24 h after wine administration.The pathological changes were observed after HE and amylase-periodic acid Schiff(D-PAS)staining，and the NF-κB and α-smooth muscle actin(α-SMA)expression was detected by using immunohistochemical method.RESULTSCompared with normal group，the activities of ALT and AST were increased by 28.0%and 28.9%(P＜0.01)in model group;while SOD and GSH level decreased from 706±46 to(515±68)kU·g－1protein，and(251±61)to(126±18)mg·g－1protein;MDA content increased from(204±21)to(258±50)μmol·g－1protein(P＜0.01);and the expression of NF-κB and α-SMA significantly increased(P＜0.01).Compared with model group，the activity of ALT decreased by 18.3%and 19.8%，and the activity of AST decreased by 6.4%and 9.7%in EFCL 1.5 and 3.0 g·kg－1groups(P＜0.01，P＜0.05)，respectively;while the levels of SOD and GSH in EFCL 3.0 g·kg－1group averagely increased by 61.4%and 14.8%(P＜0.01，P＜0.05).Furthermore，the severe hepatic lesions as well as neutrophilic infiltration and ballooning degenerations of hepatocytes induced by ethanol were considerably reduced in EFCL 1.5 and 3.0 g·kg－1groups，and the expression of NF-κB and α-SMA was significantly downregulated(P＜0.01).CONCLUSIONEFCL has protective effect against acute alcohol-induced liver damage，which may be related with its downregurating the expression of NF-κB and inhibiting the proliferation of hepatic satellite cells.

Clausena lansium(Lour.)Skeels;ethanol;liver injury;antioxidation;NF-κB;α-smooth muscle actin

The project supported by Science and Technology Project of Guangdong Province(2010A040200005);Technology Project of Guangdong Province(2012B040304013);and College Student's Innovation Project of Guangdong Medical College(09ZZF010)

LI Wen-de，E-mail:gdmcli@yahoo.com.cn，Tel:(0769)2388405

R285

A

1000-3002(2012)06-0829-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.009

广东省科技项目(2010A040200005);广东省科技项目(2012B040304013);广东医学院大学生创新实验项目(09ZZF010)

官堂明(1988－)，男，硕士研究生，主要从事药理学研究，Tel:13692395050，E-mail:gtmgdmc@139.com;李文德(1977－)，男，副教授，硕士，主要从事药理学研究。

李文德，E-mail:gdmcli@yahoo.com.cn，Tel:(0769)2388405

2012-03-25接受日期:2012-09-19)

(本文编辑:齐春会)