探讨影响青霉素发酵产率的因素及过程控制

王庆起

探讨影响青霉素发酵产率的因素及过程控制

王庆起

1 陈肖庆，黄乐毅.内酞胺类抗生素［M］.上海:科学文献出版社，1987.

2 徐亲民.抗生素工艺学［M］.北京:中国建材工业出版社，1994.

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本文以青霉菌为出发菌株，论述了青霉素的发酵生产的一般流程、影响发酵产率的因素及发酵过程控制。

1.青霉素的发酵生产

(1)菌种保存

青霉素生产菌种一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子［1-2］。也可以用甘油或乳糖溶液做悬浮剂，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液或营养菌丝体。

(2)青霉素的发酵生产

种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个过程，孢子培养以产生丰富的孢子(斜面的孢子培养)为目的。而种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体(种子罐的培养)为主要目的。

(3)青霉素的工艺要点

①生产孢子的制备将砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基进行斜面培养后移到大米或小米固体培养基上，于25℃培养7天到孢子成熟后进行真空干燥，并以这种形式低温保存备用。

②生产种子的制备 种子制备时以每吨培养基不少于200亿孢子的接种量，接种到以葡萄糖、乳糖和玉米浆等为葡萄糖的一级种子罐内，于(27+-1)℃培养40h左右，控制通气量为1:3m3/(m3 min)，搅拌转速为300-350r/min。

③发酵生产发酵以葡萄糖、花生饼粉、麸质水、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺和碳酸钙为培养基。发酵阶段的工艺要求如表1所列对于分批发酵来说，这一过程又分为菌体生长和产物合成两个阶段。

(4)影响发酵产率的因素及过程控制①基质浓度的影响青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生长合成的最好碳源，葡萄糖次之，但必须控制其加入浓度，因为它的分解代谢物会抑制抗生素合成酶形成而影响青霉素的合成。可以采用连续添加葡萄糖的方法来代替乳糖。在分批发酵中，常常因为前期基质浓度过高对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制，而后期基质浓度低，限制了菌丝生长和产物合成。为了避免这一现象，在青霉素发酵中，通常采用分批补料操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加，以维持一定的最适浓度。目前，糖浓度的检测尚难在线进行，故葡萄糖的流加不是根据糖浓度控制，而是间接根据pH值、溶氧或二氧化碳释放率予以调节。

②前体的影响及控制 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺等均可作为青霉素G的侧链前体。青霉菌可将前体直接结合到产物分子中，也可作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径被菌利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性，而现代工业生产所用的菌种，前体转化率为46%-90%，为了避免前体加入浓度过大而对菌体产生不利影响，从基础料中加入0.07%外，其余按需要同碳源一起补入。

前体对青霉菌的生长发育有毒性，其毒性大小取决于培养基的pH值和前体的浓度。苯乙酰胺在碱性时毒性较大，pH=8时即抑制菌体生长;苯乙酸在酸性时毒性较大，碱性时不抑制菌丝体生长;pH在中性时苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1%时(除苯氧乙酸外)，青霉素的生物合成均会下降，尤以苯乙酰胺更甚。一般认为发酵液中，前体浓度始终维持在0.1%为宜。培养基成分对前体的氧化程度有较大影响。合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少，这可以由前体氧化的中间产物-邻羟基苯乙酸在培养基中的积累得到。

③pH值的影响及控制青霉素发酵的最适pH一般认为是6.5～6.9，应尽量避免超过7.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速水解。在青霉素发酵过程中，pH值是通过下列手段控制的:如pH值过高，可加糖、硫酸或无机氮源;pH值较低，可加入CaCO3、NaOH、氨或尿素，也可提高通气量。

④温度的影响及控制

青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差异，对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度是不一样的，一般生长的适宜温度为27℃。而分泌青霉素的适宜温度是在20℃左右。生产上采用变温控制法使之适合不同发酵阶段的需要。如采用从26℃逐渐降温至22℃的发酵温度，可延缓菌丝衰老，增加培养基中的溶氧度，延长发酵周期，有利于发酵后期的单位增长。

(5)溶氧的在线控制溶氧浓度是氧传递与氧消耗的动态平衡，而氧消耗与糖消耗成正比，当溶氧浓度将到30%饱和度以下时，青霉素产量急剧下降;低于10%饱和度时，则造成不可逆转的损失。

(6)补料的影响在发酵过程中与料液一起补入表面活性剂，如新洁尔灭50×10-6或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、三油酸酯等非离子表面活性剂，能增加青霉素的产量。.

表1 发酵阶段的工艺要求

发酵时间的长短应从以下三个方面考虑:①累计产率最高;②单产成本最低;③发酵液质量最好。

操作变量 要求水平 操作变量 要求水平发酵罐容积 200m3 发酵液pH值180～220h 6.5～6.9装料率 80% 初始菌丝浓度 1～2kg(干重)/m3输入机械功率 2～4kW/m3 补料液中葡萄糖浓度 约500kg/m3空气流量 48～72 m3/(m3h) 葡萄糖补加率 1.0～2.5kg(m3h)空气压力(表压) 0.2MPa 发酵液中液氨浓度 0.25～0.3kg/m3发酵罐压(表压) 0.035～0.07MPa 发酵液中前体浓度 1kg/m3液相体积传氧系数(K1a) 200/h-1 发酵液中溶氧浓度 ＞30%饱和度发酵液温度 25℃ 发酵周期