在线微载体肝细胞荧光示踪研究

刘 勇，汪 艳，夏武政，周焕城，高 毅，4

1.湖北医药学院附属人民医院重症医学科，湖北十堰 442000;2.南方医科大学珠江医院再生医学研究所;3.广东省人民医院普外科;4.南方医科大学珠江医院肝胆二科

在线微载体肝细胞荧光示踪研究

刘 勇1，2，汪 艳2，夏武政3，周焕城2，高 毅2，4

1.湖北医药学院附属人民医院重症医学科，湖北十堰 442000;2.南方医科大学珠江医院再生医学研究所;3.广东省人民医院普外科;4.南方医科大学珠江医院肝胆二科

目的拟探讨SYTO/EB在微载体细胞培养中活体细胞原位示踪的应用价值。方法采用活细胞核酸染色剂(SYTO13)和溴化乙啶(EB)2种核酸染色剂对微载体生长的细胞进行双重染色，荧光显微镜下通过颜色不同判断细胞的活力状态并计算出活力百分比。以间接活力测定的四氮唑盐法同时对肝细胞进行活力的检测，并将结果进行比较。结果2种方法测定的结果均可显示微载体生长的肝细胞。但SYTO/EB法更灵敏，可精确计数。结论SYTO/EB测定微载体肝细胞的活力快速、灵敏且简便，并可原位观察细胞的活力，不失为一种可取的微载体活力检测方法。

微载体;染色;活细胞

微载体广泛被用于贴壁细胞的培养中。一系列新型的微载体如多孔微载体被研发，投入到细胞培养、疫苗生产等［1-4］。但目前应用的微载体特别是多孔微载体，由于透光性，而难以在细胞培养时采用常规显微镜观察到细胞分布、细胞形态和活力。多孔微载体呈黄褐色，因而不易将细胞同背景区分［5］。支架内生长的细胞也难以观察。常规使用的细胞活力染色剂如台盼蓝易将微载体一起染色，降低了区分度。MTT染色的黑色与背景黄褐色的区分度也不高［6-7］。寻找一种具有良好区分度，便于随时观察活体细胞的示踪方法具有重要实际意义。活体细胞荧光染色已经有成熟应用的经验。SYTO/EB是一种高性能荧光染色剂，能够以不同的颜色区分活细胞和死细胞［8-14］。我们拟探讨SYTO/EB在微载体细胞培养中活体细胞原位示踪的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验设备 CO2孵箱为Thermo Forma Model3111(美国);荧光显微镜为 OLYMPUS相差显微镜(日本);电子照相系统为OLYMPUS照相系统(日本);其余试剂均为市售分析纯产品。

1.2 主要药品和试剂 SYTO 13购自 Invitrogen公司(美国)，EB购自EHSY西域公司，胎牛血清购自杭州四季公司。

1.3 细胞培养方法，形态和活力的检测 Cl-1细胞采用MEM培养基 ，置孵箱中，37℃、饱和湿度、5%CO2、95%空气，14～20 r/min旋转培养，第一个24 h换液1次，此后每48 h换液1次直至实验结束，每次换液80%。HepFIMMU采用1640培养基，培养方法同上。每天换液前后在倒置相差显微镜下观察培养肝细胞的生长情况及形态变化。

1.3.1 MTT法:MTT是一种水溶性四唑盐，在缺乏酚红时，接触培养基或盐溶液后呈黄色。但当脱氢酶破坏四唑环时，转变成不可溶的紫色物。活性细胞线粒体的脱氢酶可以促使MTT转变成不可溶的紫色的甲暨，从而可与死细胞相区分。不可溶的甲暨溶于异丙醇，在一定波长下产生一定的吸光度，并与浓度呈量效关系。MTT细胞检测方法如下:将50 mg MTT溶于10 mL PBS，然后过滤灭菌，4℃下避光保存。检测时将10 μL MTT溶液加到置有100 μL细胞悬液的96孔平板中，或直接加到富集的细胞单层中。然后将样品在37℃孵育2 h，继之培养基被移除，加入100 μL异丙醇。摇匀样本直至黑蓝色的甲暨完全溶解。

1.3.2 SYTO/EB荧光染色法:SYTO 13是一种活细胞核酸染料。EB在细胞壁损伤时才能进入细胞，与核酸结合形成红色的复合物。SYTO 13进入活细胞，与核酸结合，并在紫外线下发出绿色荧光。与其他SYTO染料相比，SYTO 13的穿透力最强。SYTO 13和EB的配制:SYTO 13以1.25 mmol的BME溶液保存于－20℃冰箱中。配制SYTO 13和EB混合液时添加100 μL EB和10 μL SYTO于1 mL的MEM培养基中。微载体检测:从微载体溶混悬液中均匀振荡后提取2 mL液体，放置到15 mL塑料离心管中。静置后抛弃上清，加入SYTO 13和EB混合液，在室温下孵育2 min。然后PBS清洗两次，置于有凹面标本架的载玻片，覆盖盖玻片后在荧光显微镜下观察

1.4 图像分析 采用IMAGINE PRO PLUS软件进行分析。不同荧光相片的合并:①先调整图像对比及亮度，分别转换成灰度图片。② 对其中一张进行co-localization操作，以合成双荧光相片。

1.5 统计细胞数量 步骤如下:① 打开 IMAGINE PRO PLUS。②导入待分析图片。③ 点击count/size工具，在弹出的窗口中选中automatic bright objects，再点击count。调出statistics窗口就可以看到自动计数结果了。④ 数据过滤:调出 count/size中的 select measurement窗口，点击中间filt range窗口中的area。再点击下面的edit range按纽，调出edit range窗口，选择合适的上限和下限。⑤统计数据:记录过滤后的计数统计结果。

1.6 光密度强度时间曲线绘制 分别选择微载体上荧光强度最强和MTT染色最深的细胞，采用IMAGEINE PRO PLUS测量光密度值，并制作光密度强度时间曲线，比较SYTO/EB法与MTT法的差异。

1.7 形态学观察 每天换液前后在倒置相差显微镜下观察培养肝细胞的生长情况及形态变化。

2 结果

2.1 微载体培养细胞的荧光染色结果 SYTO/EB法可以清晰显示Cytodex 3微载体单个细胞。绿色为活细胞，红色为死细胞。MTT法可以显示活细胞，但不能清楚的区别单个细胞，不能计数，无法区分死活细胞(见图1、图2)。

2.2 SYTO/EB法的准确性 微载体及细胞分为处理组和对照组。处理组经75%乙醇浸泡半小时，对照组不加以干预，然后SYTO/EB法染色观察。治疗组细胞均呈红色，而对照组均呈黄绿色。提示SYTO/EB法能很好的区分死活细胞。MTT法的结果类似，提示对细胞进行的灭活处理是成功的(见图1、图2)。

2.3 SYTO/EB法光密度时间曲线图及不同时间的显像图 随时间延长，SYTO/EB法的荧光强度也相应改变。SYTO值逐渐减弱，EB值逐渐增强(见图3)。

图3 SYTO/EB法光密度时间曲线图Fig3 Diagram of curves of optical density and time by SYTO/EB method

2.4 微载体细胞计数 各种支架材料对细胞的相容性差异很大，Cytodex 3的细胞培养能力最小(80～120)，次之为Cytopore(150～190)，最高为丝素支架(160 ～180)，与文献报道相近［3，15-16］，表明所采用计数方法可靠性高。

3 讨论

20世纪50年代合成溴化乙锭(3，82二氨基262乙基252苯基菲啶嗡溴化物)是为寻找菲啶类化合物作为有效的抗锥虫药，溴化乙锭是筛选过程中最成功的化合物［17］。除了在兽医学方面的应用外，溴化乙锭在分子克隆的发展中起到了重要的作用，低浓度溴化乙锭染色作为检测琼脂糖电泳中的微量DNA的经典方法，沿用至今已有20余年，其也被作为常规核酸染色剂广泛用于细胞的计数检测，溴化乙锭在这些方面的应用主要得益于其荧光性质和嵌入双链DNA碱基的能力。但EB的分子量较大，不能自由穿过细胞膜，只有在细胞死亡或细胞损伤细胞膜出现裂隙时才能进入细胞内，与DNA结合，在一定的激发和发射光谱下发出红色荧光［18-19］。SYTO 13核酸染色剂是一种新的穿透性核酸染色剂，该染色剂可穿透活细胞膜，与核酸DNA/RNA相结合，在一定的激发和发射光谱下发出绿色荧光。根据这两种核酸染料的这两个性质，可以分辨出染色后微载体培养的肝细胞的活力状态，再通过图像分析软件计算出活细胞的百分比。

本研究证明SYTO 13/EB法染色用于在线微载体检测细胞活力具有显著优势:① 步骤简单快捷，整个步骤仅需要几分钟;②与MTT染色相比，细胞活力可以显示到单个细胞;③便于图像分析软件进行计数等分析。SYTO 13/EB法可以直接观察到微载体上培养细胞的活力状态，染色时间短，操作简便，并可以定量分析，优于传统的MTT法，应作为微载体培养细胞的首选活力评价法。

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Improved microscopic observation of mammalian cells on microcarriers by fluorescent staining

LIU Yong1，2，WANG Yan2，XIA Wuzheng3，ZHOU Huancheng2，GAO Yi2，4
1.Department of Intensive Care Unit Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000;2.Institute for Regeneration Medicine，Zhujiang Hospital，Southern Medical University;3.Department of General Surgery，Guangdong Provincial People’s Hospital;4.Second Department of Hepatobiliary，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，China

ObjectiveTo develop an assay for viability detection of liver cell cultured on the Cytodex 3 in situ.MethodsTwo nucleic acid dyes，SYTO 13 and ethidium bromide(EB)were used to assess the viability of liver cells.Cells were stained with SYTO 13/EB.The viability of cells was determined by fluorescence microscope，and compared with MTT assay.ResultsAlthough the cell number and morphology could be clearly seen with the Cytodex 3，but cells viability could not be discerned.No cell was obviously visible inside the gelatin beads，although some cells were seen on the external surface in MTT assay.When cells were cultivated as aggregates，this FDA/EB staining technique could also be applied to such a system.High viability could be seen in large clumps of cells.ConclusionThis staining technique is to be simple，quick and reliable when used in microcarrier liver cell culture.This technique has been applied to a number of microcarrier.The use of this technique with macroporous microcarriers makes it a potential visualization technique in other immobilized mammalian cell systems.

Microcarrier;Staining;Living cells

Q813

A

1006－5709(2012)04－0328－03

2011-10-33

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.04.011

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA02A141);广东省科技计划项目(2007A032100005)

刘勇，副主任医师，主要研究方向:危重病，E-mail:liuyongjoy@hotmail.com

高毅，教授，主任医师。E-mail:gaoyi6146@163.com