100～700 mL液体培养基的微波灭菌效果观察

梁莹，梁薇，邓毛子

(1.咸宁学院基础医学院病原系实验室，湖北咸宁437100;2.肇庆学院体育与健康学院，广东肇庆526061)

目前，医院对医疗药品、器械的微波消毒与灭菌频率多为2 450 MHz的箱式微波炉，因为此类装置与频率更适宜于对小型和批量物品的处理［1］。关于培养基微波灭菌的报道已有不少，但是，有关照射过程中沸点时间上的灭菌效果还未见报道。本实验室采用2 450 MHz，700 W微波炉对少量液体培养基进行3种状态的沸点时间灭菌效果观察，主要为快速消毒或在紧急的没有高压消毒灭菌器的情况下，提供可靠的更充足更有效的最佳灭菌数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌枯草杆菌黑色变种芽胞菌片ATCC9372(Bacillus subtilus var.mucoides)生物指示剂，染菌量1.0×108cfu/片，北京鑫四环消毒技术开发中心研制。金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphyloccocus aureus)、大肠埃希菌ATCC25922(Escherichia coli)、普通变形杆菌ATCC49132(proteus vulgaris)，华中科技大学同济医学院医学微生物学教研室提供。

1.1.2 培养基营养琼脂(生化试剂BR北京奥博星生物技术有限责任公司);普通液体培养基(由本室提供);微量糖管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、尿素均来自杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.1.3 试剂蛋白胨(生化试剂，BR北京奥博星生物技术有限责任公司)、牛肉膏粉(生化试剂，杭州天和微生物试剂有限公司)、NaCl(分析纯，西安化学试剂厂)、NaOH(分析纯，西安化学试剂厂)、pH试纸(天津塘沽化学试剂厂)、电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。革兰染液、鞭毛染液(由本室按《病原生物学实验教程》［2］配制)。

1.1.4 设备格兰仕微波炉(P7021TP-6型，700 W，2 450 MHz，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)、电热恒温培养箱(DHP-9082D型，上海申贤恒温设备厂)、全自动不绣钢双层立式电热蒸汽压力消毒器(上海三申医疗器械有限公司)、垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供试菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌及枯草杆菌黑色变种芽胞菌片1片分别放入2 mL无菌普通液体培养基中，置37℃的恒温箱中培养24 h，复活后，接种于普通营养琼脂平板培养基上，置37℃恒温箱中培养24 h，连续传代3次增强细菌的活力。再用无菌普通肉汤配成浓度为1×109cfu/mL［3］的菌液，参照卫生部《消毒技术规范》［4］(2002版)中规定操作方法进行，保存于4℃冰箱，备用。

1.2.2 普通营养琼脂平板的制备按照营养琼脂瓶上的说明，用电子天平称取营养琼脂粉90 g，加入2 000 mL蒸馏水，加热煮沸溶解，分装500 mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌后，每个无菌平皿倒入20 mL，备用。

1.2.3 普通液体培养基的制备［5］用电子天平称取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，蒸馏水1 000 mL，以此比例配制实验所需用量，加热彻底溶解后，用NaOH调pH值为7.5，过滤，用250 mL三角瓶分装，每瓶100 mL，包装好，取29瓶高压蒸汽灭菌，备用。其他需用量直接用于微波灭菌实验。将高压蒸汽灭菌后的肉汤倒入3支试管，每管2 mL，备用。

1.2.4 微波对液体培养基沸腾点时间测试将100 mL的液体培养基设置为7个测试组，第1组100 mL×1瓶，第2组100 mL×2瓶，第3组100 mL×3瓶，第4组100 mL×4瓶，第5组100 mL×5瓶，第6组100 mL×6瓶，第7组100 mL×7瓶(微波炉最大容量)。设定微波高火。试验前三角烧瓶的棉塞要注入1 mL蒸溜水，防止棉塞干枯。实验主要观察每组被照射的液体培养基中液体表面沸腾所需的时间、液体底部开始沸腾所需的时间及所有瓶完全沸腾所需的时间，结果见表1。测试完成后，每组液体培养基倒出3支试管，每管2 mL。同时取1 mL分别加入无菌琼脂平板中，设3个重复。均置37℃恒温箱培养24 h，观察有无细菌生长，结果见表2。

1.2.5 微波杀灭芽胞杆菌效果的试验实验分组与1.2.4相同，将浓度为1×109cfu/mL的枯草杆菌黑色变种芽胞菌菌液1 mL，分别加入经高压蒸汽灭菌的100 mL液体培养基中，每组分别按微波照射后不生长细菌的最后时间4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min进行试验，分别置微波高火作用，同时另一瓶100 mL加菌液不照射，作阳性对照，均置37℃恒温培养箱培养24 h后，各组倒3支肉汤管，每管2 mL。并取1 mL分别加入琼脂平板中，设3个重复，37℃恒温培养箱培养24 h，肉眼观察有无细菌菌落在琼脂平板上生长。

1.2.6 液体培养基无菌检测及保质有效期试验 将有效时间被灭菌的试验组肉汤培养基、高压灭菌过的微波杀灭芽胞杆菌试验组液体培养基及各试验组琼脂平板放置于37℃恒温培养箱连续观察7 d，置室温约20℃空气流通少的地方，连续观察15 d的变化。

1.2.7 微波作用的液体培养基质量检测将微波作用后达到灭菌效果的各试验组肉汤管及对照组高压蒸汽灭菌后的肉汤管分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及普通变形杆菌，置于37℃恒温培养24 h观察其生长特征。然后，①分别将它们转种无菌琼脂平板中，置37℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落生长情况;②分别进行革兰染色［6］及鞭毛染色［7-8］，具体操作见《病原学与免疫学实验教程》和《医学微生物学实验指导》。完成后油镜下观察形态、大小、染色性;③分别进行微量糖管葡萄糖发酵试验、苷露醇试验、克氏双糖试验、尿素酶试验等生化反应，观察微量糖管中测试菌的分解能力、产酸产气、颜色等有无变化。

2 结果与分析

2.1 微波对液体培养基沸点的各时间及灭菌效果

表1 各测试组微波照射沸点时间Table 1 The boiling time of all test grorp

表2 各测试组沸点时间细菌生长情况Table 2 The bacterial growth phenomenon of all test group at different boiling time

由表1、表2可知，液体培养基在微波照射下取得3种状态的沸腾时间。在表面沸腾时间及液体底部开始沸腾时间上琼脂平板及肉汤管均有细菌生长，管中液体均匀混浊，琼脂平板生长灰白色大小不等的菌落。在全部各瓶完全沸腾的时间上琼脂平板及肉汤管均无细菌生长，管中液体清亮，平板无菌落。

2.2 微波杀灭芽胞杆菌效果的试验

枯草杆菌黑色变种芽胞菌在高压灭菌的各肉汤管中，经4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min微波有效时间的作用后，接种在琼脂平板及肉汤试管中均无细菌生长，肉汤管中液体清亮。阳性对照管液体混浊，管底有絮状沉淀，琼脂平板表面形成圆形、粗糙、灰白色菌落。

2.3 无菌检测及保质有效期试验

通过7 d的无菌检测和在20℃左右室温下连续观察15 d，照射后的肉汤培养基及琼脂平板上均无细菌生长。肉汤管清亮，无混浊现象。

2.4 液体培养基质量检测

2.4.1 接种测试菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及普通变形杆菌在试验组肉汤管及对照组肉汤管中均呈均匀混浊状态生长。在无菌琼脂平板中，金黄色葡萄球菌均为菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1～2 mm，金黄色;大肠埃希菌均为圆形凸起，直径2～3 mm的光滑型灰白色菌落;普通变形杆菌均呈扩散生长，接种部位为中心的厚薄交替的灰白色波纹状菌苔。由此可见，同一菌株在不同培养基上的生长现象无明显差异。

2.4.2 革兰染色将试验组肉汤管及对照组肉汤管中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及普通变形杆菌分别进行革兰氏染色及鞭毛染色后，油镜下观察到:金黄色葡萄球菌均为G+，球型，直径0.8 μm左右，排列成葡萄串状，无鞭毛的球菌;大肠埃希菌均为G-短杆菌，大小0.5 μm×(1～3)μm。具有周鞭毛;普通变形杆菌均为G-两端钝圆的小杆菌，大小(0.4～0.6)μm×(1.0～3.0)μm，具有周鞭毛。由此，试验组肉汤管和对照组肉汤管上的细菌形态染色特征均无明显差异。

2.4.3 微量糖管试验金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及普通变形杆菌在试验组各肉汤管及对照组各肉汤管培养后各试验菌的生化反应:金黄色葡萄球菌均分解葡萄糖，产酸不产气;分解甘露醇产酸，分解尿素;大肠埃希菌均分解葡萄糖、乳糖产酸产气，分解甘露醇，不分解尿素;普通变形杆菌均分解葡萄糖产酸产气，不分解乳糖，分解甘露醇和尿素。

3 讨论

100～700 mL液体培养基在2 450 MHz，700 W的微波照射下得到3种状态的沸腾时间(表1)，表面沸腾到底部沸腾这2个时间都不能有效杀灭细菌。随着整个被照射的培养基完全沸腾，为最佳的灭菌时间，也是达到最有效的灭菌效果(表2)。这可能就是热效应及非热效应。当生物体受到微波辐射时，微波透射生物体被吸收后所产生的综合生物效应结果［9］。

利用国际通用消毒生物指标菌枯草杆菌黑色变种芽胞菌对被微波照射的液体培养基进行质控，并严格按照卫生部的《消毒技术规范》执行。本实验结果表明，枯草杆菌黑色变种芽胞菌在液体培养基中被微波有效地全部杀灭，说明微波作用不但能杀灭细菌的繁殖体，更能杀灭细菌的芽胞，并且无菌检测7 d未见长菌，室温保存15 d无细菌生长，完全符合《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB15981-1995)的国家标准。而金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及普通变形杆菌作为质检菌，经过革兰染色及鞭毛染色、分离接种培养、生化反应等一系列实验，证明被作用后的液体培养基的营养成分没有受到影响，细菌的形态染色特征、细菌的生长特性、细菌的分解能力均在正常范围内。

据报道，利用2 450 MHz，700 W微波消毒母乳，可以预防南美洲锥虫病［10］;应用微波辐射处理工业废水，能杀灭大肠埃希菌、沙门菌、葡萄球菌、绿脓杆菌和旋毛(线)虫等微生物［11］。谷小燕等［12］报道，可将微波灭菌后的方盒替代临床治疗护理中的无菌盘;王瑞等［13］报道，用微波对麦苗粉杀菌有利产品品质和营养成分的保持。资料表明，微波消毒灭菌不但可在医疗卫生方面广泛应用，而且已经逐渐深入到工业、农业、食品等各个领域。

本文通过实验表明，灭菌量与灭菌时间成正比，随着灭菌定量的增高，灭菌时间也随着相应增长，但未见有规律的时间变化，这可能与微波炉内的空间、分装液体的三角瓶玻璃厚薄有关，微波的灭菌机制较为复杂，有待进一步的研究讨论。尽管如此，微波炉用于液体培养基的消毒灭菌还是最安全可靠、方便快捷、经济实惠的一种方法，具有较高的实用价值，值得广泛推广。

［1］ 张颖，王仙园，周娟，等.微波消毒技术研究进展［J］.中国消毒学杂志，2008，25(6):653-654.

［2］ 訾自强.病原生物学实验教程［M］.北京:人民卫生出版社，2009.

［3］ 刘波，李红，姚粟，等.枯草芽胞杆菌黑色变种ATCC 9372的特性及其应用［J］.中国消毒学杂志，2009，26(2):236-237.

［4］ 中华人民共和国卫生部.消毒技术规范［M］.北京:人民卫生出版社，2002.

［5］ 孙剑刚，邓毛子.医学微生物学实验教程［M］.北京:科学出版社，2011.

［6］ 姚旌旗，覃金红，孙剑刚.病原学与免疫学实验教程［M］.北京:科学出版社，2007.

［7］ 于爱莲.医学微生物学实验指导［M］.北京:人民卫生出版社，2005.

［8］ Murray RGE，Doetsch RN，Robinow CF.Determinative and cytological light microscopy.In:Gerhardt P，Murray RGE，Wood WA and Krieg NR.Mehthods for general and molecular bacteriology.American So-ciety for Microbiology.Washington DC，1994:35-36.

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［12］ 谷小燕，何红燕，廖建鄂，等.塑料方盒微波灭菌后替代无菌盘的实验研究［J］.护理学杂志，2010，25(5):1-2.

［13］ 王瑞，张慜，范柳萍，等.麦苗粉的微波杀菌［J］.食品与生物技术学报，2009，28(2):150-155.