海湾扇贝杂交、近交和自交家系的微卫星标记偏分离分析

王 宇, 李 莉 张守都, 郑怀平, 张国范

(1. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院 研究生院 北京 100049; 3. 汕头大学, 广东汕头 515063)

海湾扇贝杂交、近交和自交家系的微卫星标记偏分离分析

王 宇1,2, 李 莉1, 张守都1,2, 郑怀平3, 张国范1

(1. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院 研究生院 北京 100049; 3. 汕头大学, 广东汕头 515063)

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类, 行体外受精, 能自体受精也能异体受精, 因此可产生3种不同形式的交配方式： 杂交(Out bred)、近交(Inbred)和自交(Selfing)。本研究筛选了10对多态性微卫星引物对海湾扇贝4个不同近交梯度共8个家系基因型进行了遗传分离分析。从偏分离标记的个数来看, 杂家家系最多, 其次是自交一代和自交二代, 最后是近交家系。结果表明只有自交家系后代基因型存在纯合子缺失, 部分证明了显性遗传效应, 同时筛选出 3个与有害基因连锁的微卫星标记。

海湾扇贝(Argopecten irradians); 近交衰退; 微卫星; 偏分离

海湾扇贝(Argopecten irradians)1982年引入中国[1], 其人工养殖在中国迅速开展, 在世界上首次形成海湾扇贝养殖业[2-3]。海湾扇贝是典型的雌雄同体型贝类, 雌雄性腺发育基本同步, 且行体外受精, 体外发育。研究显示, 海湾扇贝可以自体受精, 也可以异体受精, 即同时存在自交和杂交两种交配方式,且后代均可以正常发育和存活, 它是遗传育种学研究的理想贝类。近交(Inbreeding)是彼此具有一定亲缘关系的个体间的相互交配, 自交是一种极端形式的近交。近交导致与繁殖力和生理机能相关的性状的表型平均值降低, 这种现象称为近交衰退(Inbreeding depression); 同时近交使生物的基因杂合度降低。近交衰退现象被人们熟知已经 2个世纪有余[4]。依照显性理论, 生物的近交衰退是由于隐性致死或其他有害基因纯合机率增加, 导致生物适合度性状(Fitness trait)或者生存能力(Viability)降低造成的[5]。和这类有害基因连锁的标记在家系中的分离倾向于不符合孟德尔规律, 也就是标记偏分离现象[6]。因此, 偏分离标记是隐性有害基因存在的重要分子效应, 为研究有害基因提供了一条更加直接的途径。本文通过分析微卫星标记在近交程度不同的海湾扇贝杂交、近交和自交家系的分离情况, 来研究近交过程中有害基因的清除, 寻找与有害基因连锁的分子标记或基因, 确定有害基因的数目和效能, 以期阐释海湾贝近交衰退遗传机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验利用8个不同近交梯度的海湾扇贝家系(表1), 提取闭壳肌组织DNA进行微卫星分析。

1.1.1 实验试剂

OMEGA公司SQ 组织DNA提取试剂盒, 引物来源参见李宏俊的博士论文[7], 由上海生工合成,Taq酶和 PCR Reaction MIX 购自东盛生物公司,5×TBE缓冲液、40%聚丙烯酰胺溶液、TEMED购自生工。

1.1.2 实验仪器

Mikro 22R高速冷冻离心机, 博日 PCR仪,ATTO电泳槽, Wide Mini Sub TM Cell凝胶成像系统。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

利用OMEGA 公司的SQ组织DNA提取试剂盒从海湾扇贝闭壳肌组织中提取基因组DNA。

表1 实验用扇贝家系信息Tab. 1 Information of bay scallop involved

1.2.2 PCR扩增

优化的微卫星PCR反应体系(15 μL)中含1×PCR Reaction MIX(包括 1.5 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPs), 正反向引物各 0.34 μmol/L, 0.34UTaq 酶(东盛)和50 ng基因组DNA。热循环程序为94°C预变性3 min; 94°C变性30 s, 49～65℃下复性30 s(表2中各座位的退火温度), 72°C延长40 s, 循环30次; 最后在72°C延伸7 min, 4℃保存。

1.2.3 电泳及结果记录

PCR产物的检测采用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶300 V电泳2～3 h, 溴化乙锭染色分型后用凝胶成像系统及相关软件(Quantity One)进行分型。每个微卫星座位根据电泳迁移率辨别等位基因, 从大到小依次记录为a、b、c、d, 无扩增条带则为无效等位基因, 扩增带为1条的为纯合子, 2条的则为杂合子,列出双亲和子代个体的基因型矩阵用于统计分析, 用Excel的χ2检验功能检验各位点子代个体基因型是否符合孟德尔遗传比例

1.2.4 微卫星标记的筛选

用8个家系共12个父母本筛选引物, 自交家系父母本在这个位点必须是杂合的, 近交和杂交家系父母本基因型有一个是杂合就说明所有的子代在这个位点有多态性(图 1)。从 44对微卫星引物中筛选10对具有多态性的引物(表 2)用于所有家系的偏分离分析。

2 结果

2.1 微卫星引物在各家系的分离情况

分别对44个微卫星位点在不同家系中的分离情况进行了统计分析(图2), 筛选出10对在各家系都有分离信息的位点, 占位点总数的 22.72%。结果表明近交和杂交家系中有分离信息的位点较自交家系多,证明他们的杂合子比例较自交家系高。另外只有在自交家系中发现了纯合子缺失的位点, 在近交和杂交家系中不存在。

图1 父母本在位点HWAD190的聚丙烯酰胺电泳图Fig. 1 PAGE photograph of pleomorphic locus of HWAD190

另外, 各家系发生偏分离位点的个数见图 3, 杂交家系发生偏分离的位点最多, 其次是自交和自交二代家系, 最后是近交家系。

2.2 各位点偏分离的P值检验

根据孟德尔遗传的分离和自由组合定律, 对各家系在特定座位的基因型比例进行了 χ2检验, 当P＞0.05时, 符合孟德尔遗传, 当P＜0.05时, 显著偏离孟德尔分离定律。各家系在每个座位基因型统计及偏分离(P＜0.05)的情况见表 3, 各家系偏分离的位点数见表3。

2.3 自交家系发生严重偏分离的标记

由表3可以看出, 在Add026(LG11)这个座位, 3个自交一代家系都发生了偏分离, 在 CC5-3和CC5-4两个家系中出现了纯合子缺失的情况, 缺少bb 这种基因型, 在 CC5-1 家系 aa：ab：bb=3：21：5, bb 这种基因型也很少, 推测 b可能是一个有害的等位基因, Add026这个座位可能与有害基因连锁。另外,CC5-3和CC5-4这两个家系在HWAD190(LG7)这个座位都有 bb型纯合子的缺失, 在另一个自交家系CC5-1中则未发生偏分离, 这个位点有可能跟有害基因连锁。

表2 实验用所有家系都有分离信息的引物信息表Tab. 2 Information of SSR primers segregated in all genetic lineages

图2 微卫星位点在各家系的分离情况Fig. 2 Segregation of loci in eight families

图3 各家系偏分离位点数Fig. 3 Numbers of segregation distortion loci in each family

在ASD258(LG1)这个生长性状连锁座位, CC5-1,CC5-3, O9这3个自交家系也都有bb型纯合子的缺失, 其P值P(CC5-3)＞P(CC5-1)＞P(O9)(其中P(CC5-3)=0.0272;P(CC5-1)=0.0027;P(O9)=0.0014),近交二代偏分离程度比一代高, 说明有害基因没有被完全剔除, 自交的过程仍然有有害基因被剔除。

?

?

2.4 生长性状连锁位点在自交家系中的子代基因纯合率分析

基因纯合率是每个个体的纯合座位与全部座位数的比率, 近交的结果使基因趋向纯合, 因此基因纯合率很大程度上反应一个群体的近交程度。在Add154(LG8)和 Asd258(LG1)这两个与生长性状连锁的微卫星位点[7], 4个自交家系中有3个自交家系子代基因的纯合率都低于50%(表5), 说明纯合子在子代中的比例减低了, 与近交衰退产生的生长性状表型平均值降低相吻合。

表4 10个座位在各家系发生偏分离情况(黑点代表有偏分离(P<0.05))Tab. 4 Segregation distortion of 10 loci in 8 families (dark spot means distortion of Segregation ratios (P<0.05))

表5 生长相关位点在自交家系中的基因纯合率Tab. 5 Rates of homozygote for growth related microsatellite loci in inbreeding lineages

3 讨论

关于引起近交衰退的机制目前有两种假设： 一个是“显性假说”[8-9], 认为在近交的群体内, 突变-选择平衡产生大量的隐性或近隐性的有害基因导致了近交衰退; 另一种是“超显性假说”[8,10-11], 即杂合位点具有杂合优势, 近交所导致的杂合子减少是性状衰退的原因。本实验通过统计各个位点在自交家系中纯合基因型是否严重减少或缺失, 发现有 3个座位在不同自交家系中都存在纯合子的缺失现象,这 3个座位分布位于不同的连锁群上, 这表明隐性有害基因在近交中作用非常重要, 且近交衰退涉及到多个相关基因,一定程度上符合“显性假说”。

由于本研究所利用的所有家系的遗传背景不完全一致, 所以很难对偏分离标记的数量随近交程度的递增做整体评价。其中CC系列的3个自交家系和2个近交家系相比, 其偏分离程度增加, 部分验证了偏分离标记随着近交程度的增加而增加。自交二代O9的偏分离比例比自交一代(3个CC5自交系)偏分离比例高, 但是因其遗传背景不完全相同, 故很难直接对近交程度对偏分离的影响做出结论。而杂交家系 NS2-DQ6和 D1-1.4中也分别出现了 5个和 7个偏分离位点, 较高偏分离标记的原因很可能是因为这些杂交家系的遗传背景比较复杂, 而遗传背景较大的个体杂交染色体的配对和重组会受到抑制,会导致严重的偏分离[12-14]。杂交家系较高的偏分离比例也可能是因为筛选出的10个引物大多来源于染色体的偏分离的热点区域[7]。

本研究从偏分离标记这一方面部分证实了近交衰退导致偏分离且偏分离程度与近交系数有一定的正相关, 自交过程还存在有害致死基因的剔除。本实验只筛选了10对多态性引物, 达不到定位有害基因的目的, 发生偏分离的位点越集中在染色体上的某一区域, 那么这一区域存在有害基因的可能性越大,要确定有害基因的位置、数目和效能最好筛选出更多的有分离信息的引物或者通过比较背景环境相同的自交和杂交家系的mRNA的表达谱来确定表达差异明显的基因(相关表达谱工作已经开始进行)。设计微卫星引物来进一步确定偏分离现象, 把近交衰退的表型性状、QTL和分子标记融为一体, 更加直观地体现近交是如何通过相关基因的表达调控最终导致表型性状的衰退。

[1]张福绥, 何义朝, 刘祥生, 等. 海湾扇贝(Argopecten irradians)引种、育苗和试养[J]. 海洋与湖沼, 1986,17(5)： 367-374.

[2]张福绥. 中国海湾扇贝养殖业的发展[J]. 海洋科学,1992, 4： 1-4.

[3]Guo X M, Ford S E, Zhang F S. Mollusca aquaculture in China [J]. J Shellfish Res, 1999, 18： 19-31.

[4]Knight T. An account of some experiments on the fecundation of vegetables[J].Philos Trans R Sco Land,1799, 159： 255-265.

[5]Charleworth B, Charleworth D, Morgan M T. Genetic loads and estimates of mutation rates in highly inbred plant populations[J]. Nature, 1990, 347： 380-382.

[6]Launey S, Hedgecock D. High genetic load in the Pacific Oyster Crassostrea gigas[J]. Genetics, 2001, 159：255-265

[7]李宏俊. 海湾扇贝微卫星标记的开发和遗传图谱的构建[D]. 青岛： 中国科学院海洋研究所, 2009：100-104.

[8]Crow J F. Dominance and over dominance [M]. Gowen J W. Heterosis. Lowa State： College Press, 1952：282-294.

[9]Daveport C B. De generation, albinism and inbreeding[J]. Science, 1908, 28： 454-455.

[10]East E M. Inbreeding in corn[J]. Report Conn Agric Exp Sta, 1908, 1907： 419-428.

[11]Shull G H. The composition of a field of maize[J]. Am Breed Assoc Rep, 1908, 4： 296-301.

[12]Zamir D, Tadmor Y. Unequal segregation of nuclear genes in plants[J]. Botanical Gazette, 1986, 147,335-358.

[13]Quillet M C, Madjidian N, Griveau Y, et al. Mapping genetic factors controlling pollen viability in an interspecific cross inHelianthussect.Helianthus[J]Theoretical and Applied Genetics, 1995, 91： 1195-1202.

[14]Grandillo S, Tanksley S D. Genetic analysis of RFLPs,GATA microsatellites and RAPDs in a cross between L.esculentumand L.pimpinellifolium[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics, 1996, 92： 957-965.

Microsatellite segregation distortion analysis of the out bred,inbred and selfed families of the Bay scallop(Argopecten irradians)

WANG Yu1,2, LI Li1, ZHANG Shou-du1,2, ZHENG Huai-ping3, ZHANG Guo-fan1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Shantou University, Shantou 515063,China)

Jan.,4,2011

Argopecten irradians; Inbreeding depression; SSR; Segregation distortion

The bay scallop(Argopecten irradians)is a hermaphroditic marine bivalve. It has male and female gonads simultaneously, and exerts external fertilization. So it has three breeding manners： outbreeding, inbreeding and selfing. In this study, 10 microsatellites primers were used to test the segregating distortion in two outbred, two inbred and four selfed families (three selfing for the first generation and 1 for the second generation). The outbred families were found to have the most segregated markers, followed by the selfed families for the first generation and the selfed-families for the second generations, and the inbred families were found to have the least segregated markers. The homozygote deficiency loci was only found in the selfed families, which means partial dominance may be the genetic basis of inbreeding, and we also found three markers might be linked to the lethal genes.

S917.4

A

1000-3096(2012)08-0109-07

2011-01-04;

2011-04-10

国家自然科学基金(30800842); 国家高技术研究发展计划(863项目, 2012AA10A410); 中国科学院知识创新工程青年人才领域前沿项目以及中国博士后基金(20090451358)

王宇(1986-), 女, 湖北鄂州人, 硕士研究生, 从事海洋分子生物学研究, E-mail：iocaswy@163.com; 张国范, 通信作者, 研究员, 电话： 0532-82898701, E-mail： gfzhang@qdio.ac.cn

张培新)