红豆杉内生放线菌的分离及活性菌株的筛选与鉴定

张 曼， 解修超，2， 陈文强，2， 邓百万＊，2， 张晓伟， 孔亚男

（1.陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723001）

红豆杉内生放线菌的分离及活性菌株的筛选与鉴定

张 曼1， 解修超1，2， 陈文强1，2， 邓百万＊1，2， 张晓伟1， 孔亚男1

（1.陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723001）

通过组织匀浆法分离红豆杉（Taxus chinensis）根、茎、叶3个部位的内生放线菌，采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性，并对抑菌活性明显的菌株进行了分子鉴定。结果表明，分离纯化得到内生放线菌55株，抑菌活性试验中共有21株表现出了不同程度的拮抗作用，占全部分离菌株的38.2%，其中4株具有明显的抑菌活性。经16S r DNA序列分析，初步鉴定3株为链霉菌属（Streptomycessp.），1株为小单孢菌属（Micromonosporasp.）。

红豆杉；内生放线菌；分离；筛选；鉴定

植物与微生物之间存在着一种复杂的微生态关系，在这个微生态中发挥重要作用的成员之一是植物内生菌，主要包括真菌、细菌和放线菌。植物内生放线菌（Endophytic Actinomycetes）是指存活于健康植物组织内部，而又不引发（至少暂时不引发）宿主植物表现出明显感染症状的放线菌［1］。这一类放线菌资源多样，在与宿主植物长期的“协同进化”中可能会在为宿主提供保护，抵御外来其它微生物的侵害等方面发挥作用，而且部分可以产生与宿主相同或相似的次生代谢产物。

近年来，国内外研究人员开展了大量有关植物内生放线菌的研究，发现其产生的活性物质种类极其丰富，主要包括抗生素、有机酸、氨基酸、维生素、甾体、酶及酶抑制剂、免疫调节剂等［2－4］。Birber［5］等从欧洲桤木根瘤分离到一株链霉菌可产生新的萘醌类抗生素，抑菌研究表明对革兰氏阳性菌有活性，对革兰氏阴性菌则无活性，对k562人白血病细胞有细胞毒性；Strobel［3］等从肯尼迪黑质蛇纹树中分离到一株能产生广谱抗生素Munumbicins的链霉菌，对耐药性细菌及疟原虫有抑制作用。另外，我国的秦盛［6］、古强［7］等人也开展了植物内生放线菌在拮抗活性方面的研究。

药用植物中因含有多种活性成分而受到广泛关注，其中的内生菌可能与宿主植物之间存在着更为特殊的关系。刘宁［8］等对云南西双版纳多种药用植物中的内生放线菌进行了抗菌和抗肿瘤研究，并从放线菌的发酵液中找到了6种化合物，其中1种为新化合物。2009年郑法新［9］等人从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）根部分离到一株内生放线菌TAR11，其发酵液对多种植物病原菌均有抑制作用。我国药用植物资源丰富，为寻找新的放线菌资源以及活性物质提供了极大的可能性。

红豆杉（Taxus chinensis）为红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）植物，是含有抗癌药物紫杉醇的珍稀裸子植物，全世界共分布有11种，我国有4种和1个变种［10］。目前，有关红豆杉内生菌的研究主要集中在内生真菌［11－12］方面，而红豆杉内生放线菌的研究报道尚少。本研究以采自秦岭山区的红豆杉（Taxus chinensis）为材料，分离其内生放线菌，并对抗菌活性菌株进行筛选以及初步鉴定，以期为植物内生放线菌的利用与开发提供方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料红豆杉（Taxus chinensis）采自陕西佛坪国家自然保护区。

1.1.2 靶标菌株大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Monilia albican），均由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。

1.1.3 培养基分离培养基：改良高氏一号培养基（可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂粉15.0 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）、改良高氏二号培养基（葡萄糖1.0 g，蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，复合维生素0.5 g，琼脂粉15 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）、海藻糖－脯氨酸培养基（海藻糖5.0 g，脯氨酸1.0 g，（NH4）2SO41.0 g，NaCl 1.0 g，CaCl22.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7 H2O 1.0 g，琼脂粉15 g，加 水 至 1 000 m L，p H 7.2～7.4）和 1／10 ATCC172培养基（葡萄糖1.0 g，可溶性淀粉2.0 g，酵母浸汁0.5 g，CaCO31.5 g，N－Z－Amine A 0.5 g，琼脂粉 15 g，加水至 1 000 m L，p H 7.2～7.4）［13］。各分离用培养基中均加入重铬酸钾75.0 mg／L，制霉菌素100 mg／L，萘啶酮酸20 mg／L，用以抑制杂菌生长［14］。液体发酵培养基：酵母膏－麦芽汁培养基（酵母粉4 g，麦芽浸提物5 g，葡萄糖4 g，琼脂粉15 g，加水至1 000 m L，p H 7.2～7.4）。

1.2 方法

1.2.1 分离取新鲜的红豆杉组织，在加有洗涤剂的水中浸洗10 min，去除表面泥沙，然后自来水冲洗2 h左右。在超净工作台中，依次为无菌水冲洗3次，体积分数75%乙醇浸泡45 s，无菌水冲洗3次，0.1%HgCl2浸泡5 min，无菌水冲洗5次。无菌解剖刀取根、茎韧皮部组织以及叶片各约5 g分别剪碎置于研钵中，各加45 m L无菌水充分研磨，取100μL匀浆涂布于各分离培养基，置于28℃下培养15～30 d。待有菌长出后，采用平板划线纯化直至为单菌落，挑取菌丝于甘油管中4℃保存备用。

1.2.2 表面消毒可靠性的检验取最后一次冲洗用的无菌水100μL涂布于各分离培养基，28℃下培养30 d，检查消毒效果。

1.2.3 发酵培养将纯化好菌株接种于50 m L酵母膏－麦芽汁培养基中，28℃，160 r／min发酵7 d。10 000 r∕min离心20 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后将所得滤液4℃保存备用。

1.2.4 抗菌活性测定采用滤纸片扩散法［15］测定全部分离菌株发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的拮抗作用。

1.2.5 菌株鉴定在1／10 ATCC172培养基上，28℃培养抗菌活性明显的菌株10 d，观察其菌落形态及培养特征。采用溶菌酶－SDS法［16］提取抗菌活性明显菌株的总DNA。以细菌通用引物27F：（5′－AGA GTTTGATC－CTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′） 扩 增 其16S r DNA 序列。PCR反应体系（25.0μL）：2×Taq PCR Mix 12.0μL，10.0μmol∕m L的引物各1.0μL，DNA 模板2.0μL，灭菌双蒸水9.0μL。PCR反应条件：94℃5 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。用1.0 g／d L的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，由上海桑尼生物科技有限公司进行双向测序。将所测序列提交到NCBI进行Blast检索，下载同源性较高的数据，生成Fasta格式的文件。用Clusta－X软件对所得序列进行人工校正及比对分析。利用Mega5，按照N－J法聚类，选择1 00个重复做Bootstrap值分析，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 表面消毒的可靠性

在用最后一次冲洗用无菌水涂布的平板上，28℃下培养30 d，未见有放线菌菌落长出。由此证明，经分离并多次纯化后得到的放线菌均为红豆杉内生放线菌。

2.2 红豆杉内生放线菌的分离

经表面消毒、采用组织匀浆法进行了4次内生放线菌，经过纯化，按菌落形态，借助显微镜，排除重复，共得到放线菌55株（如表1）。

表1 红豆杉不同组织部位分离得到的内生放线菌Tab.1 Different tissues of endophytic actinomycete from Taxus chinensis

表1结果所示，红豆杉3个部位中内生放线菌的分布数量依次为根＞茎＞叶，可见根为红豆杉内生放线菌分布最多的部位。从根中分离到32株，占分离菌株总数的58.2%；茎中分离到15株，占分离菌株总数的27.3%；叶中仅分离到8株，占分离菌株总数的14.5%。

2.3 分离菌株的抗菌活性

采用滤纸片扩散法对55株内生放线菌的发酵液进行抗菌活性研究，有21株表现出了不同程度的拮抗活性，占全部分离菌株的38.2%（如表2）。

表2 红豆杉内生放线菌对靶标菌的的拮抗作用Tab.2 Antagonistic action of endophytic actinomycete from Taxus chinensis

表2结果所示，在具有抗菌活性的分离菌株中，以TA17、TA25和TA45的抗菌谱最广，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和白色念珠菌均有活性，其中对前两种靶标菌的抑制作用明显，抑菌圈直径达27.0 mm。此外，实验中发现，TA42除了对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制活性之外，对白色念珠菌的拮抗活性属所有菌株发酵液中最强，抑菌圈直径为21.0 mm。能拮抗沙门氏菌活性菌株最少，仅为4株，占全部活性菌株总数的7.3%，所有菌株均对铜绿假单胞菌不表现抗菌活性。

2.4 抗菌活性菌株的鉴定

经过抗菌活性测定，55株内生放线菌中共有21株表现出了不同程度的拮抗作用，依据抑菌圈直径大小，筛选出4株具有较强抗菌活性的菌株进行了形态特征观察和16S r DNA基因序列分析，菌株编号分别为：TA17、TA25、TA42和 TA45。

2.4.1 形态特征观察在1／10 ATCC172培养基上，28℃培养10 d后，菌落形态、基内菌丝体生长、气生菌丝体及可溶性色素各有不同（如表3）。

表3 4株内生放线菌的形态分类Tab.3 Morphological classification of 4 endophytic actinomycetes

依据《放线菌分类基础》［17］进行形态分类，初步将菌株TA17、TA42和TA45归为链霉菌属（Streptomyces）；TA25归为小单孢菌属（Micromonospora）。

2.4.2 16S r DNA基因序列分析对菌株TA17、TA25、TA42和TA45进行总DNA的提取、16S r DNA基因的PCR扩增和双向测序。根据16S r DNA基因序列，利用 Mega5，按照N－J法聚类，选择1 000个重复做Bootstrap值分析，构建了系统发育树（如图1）。

图1结果所示，4个菌株与相应模式菌株的相似度均在98%以上。其中TA17、TA25和TA45分别与已发表菌株Streptomyces flaveus、Micromonospora endolithica和Streptomyces carpaticus聚类在同一个分支上，相似度最高；TA42与Streptomyces chryseus、Streptomyces roseogriseus的亲缘关系最为相近。基于形态特征和16S r DNA序列分析，初步确定TA17、TA42和TA45为链霉菌属（Streptomycessp.）的已知种，TA25为小单孢菌属（Micromonosporasp.）的已知种。

3 结语

从植物中分离放线菌，材料消毒与杂菌抑制剂的选择是决定分离成败的关键步骤，植物表面及组织内通常附着有比较多的真菌和细菌，培养时会快速布满整个平板，不利于放线菌的分离。实验表明，本实验确定的消毒时间及抑制剂浓度能有效阻止杂菌污染，当然这也跟植物材料的树龄及致密程度有关。

由于植物内生放线菌来自独特的生存环境而成为人们寻找新的放线菌资源和活性物质的重要来源，目前关于此类微生物的分离与拮抗菌株筛选已成为抗生素、生物防治等领域研究与开发的一项重要工作。本研究共分离得到55株内生放线菌，自根部所分离到的菌株有32株，占分离菌株总数的38.2%，明显高于茎部和叶部，与 Thongchai Taechowisan［18］等人从不同组织中内生放线菌的分离数量与所占比例基本一致，这可能与根部最为接近放线菌的大本营－土壤有关，为放线菌入侵植物皮层提供了便利。活性实验显示，（1）55株内生放线菌发酵液中有38.2%的分离菌株显示出了不同程度的抗菌活性，略高于朱文勇［19］等人对喜树内生放线菌的抗菌活性测定结果，可见利用植物内生放线菌在筛选新颖抗生素方面具有较强的潜在价值。（2）数据统计表明，能拮抗细菌的内生放线菌比拮抗真菌的多，其中拮抗革兰氏阳性菌（G＋）的内生放线菌明显比拮抗革兰氏阴性菌（G－）的多，这与大多数土壤放线菌的总体活性结果一致。另外有3株链霉菌（Streptomycessp.）和1株小单孢菌（Micromonosporasp.）的发酵液对供测试的4种靶标细菌和1种靶标真菌均表现出了较强的抑制作用，具有作为抗生素生产菌的潜力，但其产生的抗生素类物质结构与作用机理有待进一步研究。

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Isolation，Screening and Identification of Endophytic Actinomycets fromTaxus Chinensis

ZHANG Man1，XIE Xiu－chao1，2，CHEN Wen－qiang1，2，DENG Bai－wan＊1，2，ZHANG Xiao－wei1，KONG Ya－nan1
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723001，China）

In this manuscript，endophytic actinomycetes were isolated from the root，stem and leaf ofTaxus chinensisby the method of tissue homogenate.Antimicrobial activities of endophytic actinomycetes fermentation broth were determined with filter paper and molecular identification of some potential strains were also carried out.The result indicated that 55 strains of endophytic actinomycetes were isolated，21 of them have varied antimicrobial activity，accounting for 38.2%of all strains and 4 strains have higher antimicrobial activity.Results of 16S r DNA gene sequences analysis of the 4 strains showed that 3 of them belong toStreptomycessp.，1 belongs toMciromonosporasp..

taxus chinensis，endophytic actinomycetes，isolation，screening，cation

Q 939.9

A

1673－1689（2012）05－0549－06

2011－05－11

陕西省重点实验室资助项目（08JZ21）；陕西省教育厅科研基金项目（08JK248，08JK244）；陕西理工学院科研基金项目（SLGQD0712，SLGQD0713）。

＊

邓百万（1963－），男，陕西汉中人，教授，硕士研究生导师，主要从事微生物资源保护与开发利用研究。E－mail：Dengbw2008＠yahoo.com.cn