c-FLIP及Caspase-8表达在乳腺癌组织中的表达及临床意义

潘 峥 陈 军 覃冠德 覃思繁

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显上升趋势。细胞型Fas相关的死亡区域蛋白样白介素-1转换酶抑制蛋白(FADD-like interleukin-1β- converting enzyme inhibintory protein，c-FLIP)被认为是1种重要的细胞凋亡抑制蛋白，在结构上与Caspase-8相似，但无Caspase-8的蛋白水解活性。它与含死亡结构域的Fas相关蛋白(Fas associated death domain，FADD)结合，抑制Caspase-8活化，使Caspase-8介导的蛋白酶不能发生级联反应，从而阻断Fas介导的死亡受体途径的细胞凋亡[1]。我们应用免疫组化方法检测乳腺癌与癌旁组织中c-FLIP和Caspase-8表达的情况，探讨它们在人乳腺癌中的表达情况及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2004年1月～2005年8月广西医科大学附属肿瘤医院手术切除的乳腺癌标本80例，年龄26～72岁，中位年龄43岁；患者术前均未进行任何抗癌治疗，所有病例随访5年。TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ期22例；组织学分级：Ⅰ～Ⅱ级43例，Ⅲ级37例。每例均取癌及对应癌旁肝组织(距肿瘤边缘2 cm)。

1.2 方法

免疫组织化学检查采用Envision两步法。c-FLIP浓缩型兔抗人多克隆抗体购自美国Neomarkers公司，Caspase-8浓缩型兔抗人多克隆抗体购自美国Labvision公司，抗体稀释浓度为1∶100。即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒购自福州迈新生物技术科技公司。整个过程按试剂盒说明书进行。每批染色均设已知阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断

c-FLIP及Caspase-8蛋白阳性信号均主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒为阳性细胞。由2位医师采用双盲法观察每张切片。阳性判断根据染色程度和免疫阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比综合记分。按切片中癌细胞染色强度计分：0分细胞无显色；1分呈淡黄色；2分呈棕黄色；3分呈棕褐色(染色深浅需与背景着色相对比)；再按切片中阳性癌细胞数所占的百分比评分：0分为阴性，1分为≤10%；2分为11%～50%，3分为50%～75%，4分为75%以上。染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分才算免疫反应阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS11.0软件进行χ2检验，Spearman相关性分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中c-FLIP和Caspase-8的表达

乳腺癌组织及癌旁组织中c-FLIP表达阳性率分别为72.5%(58/80)和48.8%(39/80)，2组间差异有统计学意义(χ2=9.452 ，P=0.001)；Caspase-8表达阳性率分别为23.8%(19/80)和53.8%(43/80)，2组间差异有统计学意义(χ2=15.168，P=0.000)。

2.2 c-FLIP和Caspase-8表达与乳腺癌临床病理特征的关系

通过比较c-FLIP和Caspase-8表达与临床病理特征之间的关系发现，c-FLIP表达阳性在TNM分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移、术后复发及C-erbB-2表达等组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，Caspase-8阳性表达在组织学分级、肿瘤大小等组间比较，差异有统计学意义(P<0.05) (表1)。

表1 c-FLIP和Caspase-8表达与乳腺癌临床病理特征的关系(例)

2.3 c-FLIP和Caspase-8在乳腺癌组织中表达的相关性

c-FLIP和Caspase-8表达在乳腺癌组织中表达呈显著负相关(γ=-0.380，P=0.001)(表2)。

表2 乳腺癌组织中c-FLIP和Caspase-8表达的关系(例)

3 讨论

细胞凋亡是1种由基因控制的自主性有序死亡，对保持正常生长及自身稳定有十分重要意义。在对凋亡分子的进一步研究中，发现了c-FLIP[2]，它是Fas/FasL细胞凋亡信号传导途径的抑制蛋白，在肿瘤坏死因子受体超家族的死亡受体抑制中扮演了1个重要角色。研究表明c-FLIP具有双重功能，FasL和c-FLIP的浓度对信号的传导具有决定性的作用，高浓度存在于细胞中时会抑制Fas介导的凋亡；相反，在低浓度或生理情况下，则发挥促凋亡作用[3,4]，故推测c-FLIP过量表达在肿瘤发生中起重要作用。Ryu等[5]检测了52例大肠腺癌组织，阳性表达率为78.8%，显著高于大肠息肉和癌旁正常组织。我们的研究亦得到了相近的结果，80例乳腺癌组织的阳性率显著高于癌旁组织。同时，我们的研究还发现，c-FLIP的高表达与TNM分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移、术后复发及C-erbB-2表达情况密切相关，提示其在乳腺癌的进展过程中亦起着十分重要的作用。

Caspases是1种细胞内半胱氨酸蛋白酶家族，细胞内这些酶以酶原形式存在，但能被广泛的细胞死亡刺激信号所激活。随着上游始动Caspases激活下游效应Caspases，Caspases形成自身激活瀑布样组织形式。本质上有2种主要的Caspases激活通路：线粒体-细胞色素C-Caspase-9途径和肿瘤坏死因子死亡受体超家族介导-Caspase-8途径[4]。从理论上推测Caspase-8失活可导致细胞凋亡失控，从而导致肿瘤的发生。我们的研究表明，Caspase-8在乳腺癌组织中的表达显著低于癌旁组织，且与组织学分级及肿瘤大小密切相关，提示Caspase-8可能参与了乳腺癌的发生及进展。

c-FLIP的作用底物目前已有报道的有FADD、Caspase-3、Caspase-8、Caspases-10等[6,7]，目前对c-FLIP抑制凋亡作用的具体机制较为公认的观点是Fas介导的信号可使c-FLIP的死亡效应结构域(DED)与FAD(Fas-associated death domain)和Caspase-8结合，竞争性抑制Caspase-8结合到死亡诱导复合体(DISC)上；另外类似于Caspase-8前体，c-FLIP可作为激活的 Caspase-8底物，产生1个C端被水解掉的c-FLIP蛋白，与Caspase-8紧密结合，防止Caspase-8的进一步激活，从而阻断了Fas介导的凋亡信号的传导[3]。从理论上分析，c-FLIP的高表达会使Caspase-8失活，从而导致细胞凋亡失控，进一步促进肿瘤的发生。我们的研究发现，两者在乳腺癌的表达确实存在负相关关系，提示两者在乳腺癌的发生发展中分别发挥着正负调节的作用；但结果亦表明两者仅是弱的负相关关系(γ=-0.380)，提示有更多因素参与了两者对细胞凋亡的调节，两者并非单纯的一对一的调节关系。

总之，c-FLIP高表达和Caspase-8的失活在乳腺癌的发生及发展中起了重要的作用，但其具体作用机制还有待进一步研究阐明。联合检测两者在乳腺癌中的表达情况，对揭示乳腺癌的发病原因，病情进展的评估及预后判断有着重要意义，并为乳腺癌的基因靶向治疗提供了新的途径。

[1] Clarke K,Debiasi RL,Meintzer SM,et al.Inhibition of NF-kappa B activitiy and cFLIP expression contribute to viral-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis,2005,10 (3):513.

[2] Irmler M,Thome M,Hahne M,et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP〔J〕.Nature,1997,388(6638):190.

[3] Bagnoli M,Canevari S,Mezzanzanica D.Cellular FLICE-inhibintory protein (c-FLIP) signalling:A key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer〔J〕.The International Journal of Biochemistry &Cell Biology,2010,42(2):210.

[4] Krueger A,Baumann S,Riess D,et al.Analysis of CD95 threshold signaling：triggering of CD95(FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling〔J〕.J Biol Chem,2007,282(18):13664.

[5] Ryu BK,Lee MG,Chi SG,et al.Increased expression of cFLIP(L) in colonic adenocarcinoma〔J〕.J Psthol,2001,194(1):15.

[6] Walczak H,Haas TL.Biochemical analysis of the native TRAIL death-inducing signaling complex〔J〕.Methods Mol Biol,2008,414:221.

[7] Armbruster N,Trautmann A,Bröcker EB,et al.Suprabasal spongiosis in acute eczematous dermatitis:cFLIP maintins resistance of basal keratinocytes to T-cell-mediated apoptosis〔J〕.J Invest Dermatol,2009,129(7):1696.