柱前衍生–反相高效液相色谱法测定荔枝果蒂中的氨基酸*

周雪晴，谢艳丽，赵振东，冯玉红

（海南省精细化工重点实验室，海南大学分析测试中心，海口 570228）

柱前衍生–反相高效液相色谱法测定荔枝果蒂中的氨基酸*

周雪晴，谢艳丽，赵振东，冯玉红

（海南省精细化工重点实验室，海南大学分析测试中心，海口 570228）

建立了AccQ·Tag柱前衍生-高效液相色谱法测定荔枝果蒂中氨基酸含量的方法。荔枝果蒂样品在120℃下真空水解22 h，再与AQC衍生剂进行衍生，并采用反相液相色谱法-荧光检测器进行分析，外标法计算样品中17种氨基酸的含量。17种氨基酸在35 min内可完全分离，荔枝果蒂中氨基酸的含量在2.5～25 μmol／L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数不小于0.999。方法的加标回收率在71.2%～92.0%之间，测定结果的相对标准偏差为3.16%～9.94%（n=6），方法的检出限（S／N=3）在 0.000 5～0.001 2 mg／L之间。

柱前衍生；液相色谱法；荔枝果蒂；氨基酸

荔枝(Litchi Chinensis)是中国南部出产的一种热带水果，其味道甜美，汁液丰富，享有“岭南果王”和“果中珍品”等美誉［1，2］，在海南、广东、广西和福建均有种植。荔枝肉中含有丰富的维生素C和蛋白质，有助于增强机体免疫功能，荔枝还具有消肿解毒、止血止痛的作用。氨基酸是食物和饮料中的一类生物活性成分，是重要的营养物质并影响食品的品质。水果果蒂中的氨基酸含量与水果生长和成熟程度有显著的相关性，可用于确定果实的最佳采摘成熟度［3］。

有人对荔枝中的糖、酸、蛋白质、微量元素、维生素等营养物质进行了研究［4，5］，但对荔枝果蒂中的氨基酸分析研究还鲜有报道。笔者采用柱前衍生-高效液相色谱法测定荔枝果蒂中的氨基酸含量，对不同品种的荔枝果蒂氨基酸成分进行分析，为荔枝品种的营养评价及采摘成熟度提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695型，附带2475型荧光检测器，美国Waters公司；

电子分析天平：AB265-S型，梅特勒-托利多仪器有限公司；

旋涡混匀器：IKA MS3 basic型，德国IKA公司；

超声清洗机：KS-120EI型，宁波海曙科生超声设备有限公司；

真空干燥箱：VD23型，德国Binder公司；

针筒过滤器：0.22 μm，上海兴亚净化材料厂；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Sigma公司；

17种氨基酸混合标准液：浓度均为2.5 mmol／L，美国Waters公司；

实验所用其它试剂均为分析纯；

Waters AccQ ·Fluor硼酸缓冲液（Buffer1）；

Waters AccQ·Fluor衍生剂粉末（2A）；

Waters AccQ ·Fluor衍生剂稀释液（2B）［6-7］；

AQC衍生剂：由Waters AccQ·Fluor衍生剂粉末（2A）加Waters AccQ·Fluor衍生剂稀释液（2B）得到；

大丁香、无核荔、小丁香、妃子笑4种荔枝样品：购自海口市农贸市场，取果蒂部分，粉碎备用；

超纯水：用英国ELGA超纯水仪制得。

1.2 样品处理

（1）盐酸水解

称取100 mg 果蒂样品放入150 mm×15 mm水解试管中，加入10 mL 6 mol／L 盐酸，用液氮或干冰冷冻样品直至固化，将试管抽真空直至真空计低于7 Pa，在真空下密封试管，于(110±1)℃水解22 h，得样品水解液。

（2）样品衍生化

过滤1.0 mL样品水解液，取10 μL放入50 mm×6 mm衍生管中(干燥)，加入70 μL Buffer1缓冲液，涡旋混合并加入20 μL AQC衍生剂，涡旋混合15 s。样品管用石腊膜封口，置于55℃烘箱中加热10 min，待检测。

分别取 17 种氨基酸混合标准液 1，2，4，5，10 μL，与样品同时进行衍生化。

1.3 色谱条件

Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱（150 mm×3.9 mm，5 μm）；荧光检测器：λex=250 nm，λem=395 nm ；增益：1；进样体积：10 μL；色谱柱温度：37℃；流速：1.0 mL／min；流动相洗脱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

仪器条件中流动相比例对荔枝果蒂中的氨基酸测定具有重要的影响。通过变化不同的梯度洗脱程序，确定在本实验所采取的洗脱条件下17种氨基酸在35 min内全部出峰，且具有较好的分离效果。在此条件下，以峰面积作为定量指标，17种氨基酸［天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)］标准品色谱图见图1。

表1 流动相洗脱条件

图1 17种氨基酸标准品色谱图

2.2 方法的线性方程、线性范围及检岀限

分别吸取 2.5 μmol／L 氨基酸标准液 1，2，4，5，10 μL，与样品同时衍生化后进行测定，以氨基酸溶液浓度(x)为横坐标、以色谱峰面积(y)为纵坐标绘制氨基酸的标准工作曲线，线性范围为2.5～25 μmol／L，以3倍信噪比计算检出限。17种氨基酸标准的线性方程、相关系数及检出限见表2。

2.3 方法的回收率及精密度

称取6份荔枝果蒂作为平行样，分别加入一定量的氨基酸标准溶液，按实验方法进行处理、测定，分别计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表3。

由表3可知，本分析方法的加标回收率在71.2%～92.0%之间，测定结果的相对标准偏差在3.16%～9.94%之间，可满足氨基酸测定的要求。

表2 17种氨基酸线性关系

表3 加标回收试验结果(n=6)

2.4 样品测定

应用所建立的方法对4种荔枝果蒂样品进行测定，测定结果见表4。

由表4可知，在4个荔枝品种的果蒂水解氨基酸中，以酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)为主要氨基酸，其总量超过氨基酸总量的60%，其中，大丁香以酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)含量较高，占总氨基酸的44.5%；无核荔以组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)含量较高，占总氨基酸的40.5%；小丁香以蛋氨酸(Met)含量最高，占总氨基酸的18.5%，其次是赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)；妃子笑中以组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)及缬氨酸(Val)含量较高，占总氨基酸的52.2%。4种荔枝果蒂的总氨基酸含量从大到小依次为无核荔、妃子笑、大丁香、小丁香。

表4 4种荔枝果蒂样品水解氨基酸测定结果

3 结语

采用柱前衍生-反相高效液相色谱法测定荔枝果蒂中的水解氨基酸含量，衍生化反应完全，17种氨基酸分离良好，回收率好，精密度较高，可用于类似氨基酸的检测分析。

对不同品种荔枝果蒂的氨基酸进行分析，能够为研究和开发荔枝资源，全面了解荔枝品质的形成提供重要的参考依据。

［1］崔珊珊，胡卓炎，余恺，等.不同产地妃子笑荔枝果汁的氨基酸组分［J］.食品科学，2011，32(12)： 269-273.

［2］李建国.荔枝学［M］.北京：中国农业出版社，2008.

［3］王燕.不同品种荔枝核营养成分及功能活性的研究［D］.广州：华南农业大学，2009.

［4］陈华萍，陈黎，魏育明，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定小麦中氨基酸含量［J］.分析化学，2005，33(12)： 1 689-1 692

［5］Campo C P，Garde-Cerdan T，Sanchez A M，et al. Determination of free amino acids and ammonium ion in saffron (Crocus savitus L.)from different geographical origins［J］. Food Chemistry，2009，114(4)： 1 542-1 548.

［6］刘保冬，王维，等.葡萄酒中游离氨基酸的高效液相色谱法测定［J］.分析测试学报，1997，16(6)： 5-7.

［7］朱曙东，赵昇皓.氨基酸的高效液相色谱分析［J］.色谱，1994，12(1)： 20-23.

［8］Ribeiro B，Andrade P B，Silva M B，et al. Comparative studyon free amino acid composition of wild edible mushroom species［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(22)： 10 973-10 979.

Determination of Amino Acids in Pedicel of Litchi Chinensis by AccQ·Tag–High Performance Liquid Chromatography

Zhou Xueqing, Xie Yanli, Zhao Zhendong, Feng Yuhong
(Hainan Provincial Key Lab of Fine Chem， Chemical Analytical and Testing Center of Hainan University，Haikou 570228，China)

A method for the determination of 17 amino acids in pedicel ofLitchi Chinensiswas established.The amino acids in pedicel ofLitchi Chinensiswere hydrolyzed at 120℃ in the vacuum for 22 h, then the hydrolyte were derivated by AQC reagent and determined by HPLC-FLD. The 17 amino acids were separately within 35 min. The content of amino acids in pedicel ofLitchi Chinensishad good relationship in the range of 2.5-25 μmol／L, the correlation coefficient was not less than 0.999. The recoveries were in the range of 71.2%-92.0%, and the relative standard deviations of determination results were 3.16%-9.94%(n=6). The detection limits (S／N=3) were 0.000 5-0.001 2 mg／L .

precolumn derivatization; high performance liquid chromatography; pedicel of litchi chinensis; amino acids

O657.7+2

A

1008–6145(2012)05–0022–03

doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2012.05.006

*海南大学2010年青年基金项目（qnjj1003）;海南大学研究生创新平台科研项目基金

联系人：周雪晴；E-mail： zhouxueqing001@sina.com

2012-06-19