牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

徐锋，武晓丽，徐迪，明星，魏华,，黎鹏,

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047 2.南昌大学中德联合研究院，南昌 330047 3.江西中医学院基础医学部，南昌 330004）

牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

徐锋2，武晓丽3，徐迪1，明星1，魏华1,2，黎鹏1,2

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047 2.南昌大学中德联合研究院，南昌 330047 3.江西中医学院基础医学部，南昌 330004）

通过用超声波破碎的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌的菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠，获得4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选取其中一株制备单抗，并用胶体金标记。同时抗志贺氏菌的兔多抗和驴抗鼠抗体（二抗）分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线（T线）和质控线（C线），研制了志贺氏菌胶体金快速检测试纸条。结果显示试纸条的灵敏度为105mL-1，并只与两株志贺氏菌有阳性反应外，而与其它23株常见的细菌无交叉反应。同时在检测添加有阪崎肠杆菌和长双歧杆菌的牛奶样品中，结果显示试纸条的灵敏度为106mL-1。志贺氏菌免疫胶体金试纸条的建立，为加强食品中志贺氏菌的检测工作，建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。

宋内氏志贺氏菌；福氏志贺氏菌；试纸条；检测方法

0 引言

志贺氏菌属于革兰氏阴性细胞内致病菌，是一类具有高度传染性和危害严重的食源性致病菌[1-2]。奶牛养殖过程中，受卫生条件影响，养殖环境易遭受志贺氏菌污染，对牛奶造成潜在威胁。每年全球有1.6亿人患病，而志贺氏菌感染的高发人群最主要为l～4岁的儿童[3]，严重威胁人类健康和社会经济的发展。故此，志贺氏菌被我国卫生部和农业部列为牛奶原料乳卫生指标检测的必检项目[4]。

免疫胶体金技术简便快速，避免了传统检测方法中繁琐的生化鉴定环节和PCR方法对操作人员、检测仪器及检测环境的要求，15 min即可出结果，可满足现场快速检测要求。因此，本研究旨在建立一种快速、简便筛查牛奶样品中志贺氏菌的胶体金免疫试纸条检测方法。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株

阪崎肠杆菌45401(Cronobacterspp CMCC45401)，粉尘肠杆菌(Enterobacter pulverisPESA5)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticusPVPA0125)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuriumATCC13311)，单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes54001)，白色假丝酵母(Candida guilliermondiiZ1)，肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.ColiCMCC 44496)，大肠杆菌O157:H7 EDC(Escherichia coliO157:H7 EDC)，宋内氏志贺氏菌(Shigella sonneiATCC29930)，福氏志贺氏菌(Shigella flexneriATCC29903)，藤黄微球菌(Micrococcus luteusCMCC28003)，短双歧杆菌(Bifidobacterium breveWBBR04)，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalisWBBR05)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidumWBBI01)，婴儿双歧杆菌(BifidobacteriuminfantisWBAN07)，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolensentisWBAD08)，乳双歧杆菌(BifidobacteriumlactisWLABO9)，长双歧杆菌(Bifidobac terium longumNCC2705)，植物乳杆菌(Lactobacterium plantarumATCC 8014)，唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivariusssp.salivarius1.1881)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusGG ATCC 7469)，德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbruechiissp.delbrueckii1.2624)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus1.1878)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilusG1)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricusF1)，为本实验室保存。

BALB/c小鼠购自南昌大学医学院动物科学部，浓缩型DAB试剂盒购自中杉金桥公司。

1.1.2 培养基与试剂

LB培养基；MRS培养基；PBS缓冲液（pH 7.4）；DMEM培养液（Hyclone）；胎牛血清（GIBCO）；酶标二抗（中杉金桥公司）；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（Sigma）；其他试剂均为国产分析纯化学试剂。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱；超声破碎仪；高速冷冻离心机；厌氧培养箱；BIO-DOT XYZ-3050点喷系统；Milli-Q水处理系统；HGS-201可编程切条机，ZX-6090B真空干燥箱，酶标测定仪。

1.2 方法

1.2.1 志贺氏菌的培养与抗原制备

将-80℃保存的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌菌株分别接种于LB平板上进行划线，37℃培养24 h后，挑选单菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养16 h，按1%接种量接种于300 mL LB培养液中，振荡培养20 h后，8 000 r/min，室温离心2 min收集菌体，并用PBS洗涤三遍。最终用20 mL PBS重悬菌体，经超声波(220 Hz)破碎，13 000 r/min，4℃离心10 min，收集沉淀，用PBS洗涤3遍后，混合两株菌的破碎沉淀作为免疫抗原-20℃保存。

1.2.2 单克隆抗体的制备

方法参照崔焕忠等人[5]方法免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。每只小鼠每次注射300 μg志贺氏菌细胞碎片抗原，筛选融合细胞采用新鲜培养的宋内氏志贺氏菌。抗体效价的测定参照张建群等人[6]，采用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价。单克隆抗体Ig类与亚类采用琼脂糖扩散试验进行鉴定。

1.2.3 抗体交叉反应的检测

把材料1.1.1中的25种菌株分别活化培养，并调整菌体浓度为109CFU/mL。取PVDF膜，甲醇活化30 sec，于PBS溶液中振荡15 min，取菌液各5 μL分别点于膜上，阴干后，浸入5%的脱脂乳溶液37℃封闭1 h，取出，浸入单克隆抗体稀释液，37℃孵育1 h，用PBST清洗三遍，加入酶标二抗，按照浓缩型DAB试剂盒的说明进行显色。

1.2.4 志贺氏菌免疫胶体金试纸条的制备

参照付连军等人的方法[7]制备志贺氏菌免疫胶体金试纸条，封闭剂选用0.5%的鸡卵清蛋白。

1.2.4.1 多克隆抗体和单克隆抗体的配对

采用双抗夹心ELISA进行配对实验。抗志贺氏菌兔多抗从800倍开始倍比稀释，单克隆抗体，从200倍开始倍比稀释。

1.2.4.2 胶体金标记抗志贺氏菌单抗的制备

胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法，当溶液的颜色完全变为透明的红色时，停止加热，冷却至室温，4℃保存备用。取8个2 mL离心管，分别加入1.5 mL胶体金，用浓度为0.2 mol/L的K2CO3将pH值分别调为3，4，5，6，7，8，9，10。各取1 mL不同pH值的胶体金分别加入8个2 mL离心管中。取100 μL质量浓度为1 g/L的单克隆抗体加入上述离心管中，震荡20 min后室温放置10 min，每管分别加入100 μL 100 g/L NaCl溶液，震荡混匀室温下放置10 min，记录保持红色的最低pH（X）。再将pH调为梯度X-0.8、X-0.6、X-0.4、X-0.2、X、X+0.2、X+0.4、X+0.6、X+0.8重复上述实验，以完全溶解呈均匀的透明酒红色溶液管的pH值为最佳。

蛋白标记量以目测法确定。取10个2 mL离心管，分别加入1 mL胶体金，用浓度为0.2 mol/L的K2CO3将pH值调为8.0。将待标记的抗志贺氏菌单克隆抗体逐级稀释后，各取100 μL分别加入离心管中，使每个离心管中的蛋白含量如表1，摇匀室温放置5 min，分别加入100 μL 100 g/L NaCl，混匀后静置2 h观察结果。保持红色的离心管中，所含最低蛋白量即为稳定1 mL胶体金的必须蛋白量，实际用量为最低蛋白量的120%～130%。封闭剂选用0.5%的鸡卵清蛋白

1.2.4.3 检测线（T线）包被浓度的确定

选择质量浓度为1.5 g/L驴抗鼠IgG作为质控线（C线）的喷涂浓度，将抗志贺氏菌兔多克隆抗体稀释成不同浓度，质量浓度设置为0.25，0.5，1，1.5，2 g/L，再和质量浓度为1 g/L驴抗鼠IgG分别以1 μL/cm喷涂于硝酸纤维素膜的检测线与质控线位置，37℃温箱干燥4～5 h。将标记胶体金液4℃、4 000 r/min离心30 min，沉淀10倍浓缩重悬，用点样仪将重悬液点样于结合垫上（8 μL/cm），真空干燥1～2 h。将吸水纸、样品垫、包被硝酸纤维素膜、结合垫固定于PVC底板上，切割成4 mm宽的条子。将无菌PBS缓冲液（pH=7.4）与不同浓度梯度的宋内氏志贺氏菌（108～105mL-1）分别加入不同条件的检测卡上，10～15 min后读取结果。

表1 抗体标记量确定

1.2.4.4 试纸条的组装

用BIODOT XYZ三维点样平台将抗志贺氏菌兔多克隆抗体及驴抗鼠二抗按照最佳浓度喷在NC膜上的检测线和控制线位置，置于37℃恒温干燥箱干燥8 h。同时将金标抗体按照选定的喷金量喷在胶金垫上，于30℃真空干燥箱干燥2 h。之后将滤纸、样品垫、胶金垫、NC膜、吸水纸依次搭接粘于PVC底板上，用BIODOT切割机切成4 mm宽条状后装入卡壳，置于包装袋中，加干燥剂密封，于常温下保存。

1.2.5 试纸条检测样品

将各种细菌用0.01 mol/L PBS稀释至108CFU/mL，分别取100 μL加入试纸条点样槽中，并设浓度为0.01 mol/L的PBS与混有杂菌的奶粉样本作为阴性对照，10～15 min后读取结果。将纯培养的宋内氏志贺氏菌分别用浓度为0.01 mol/L的PBS和质量分数为5%脱脂奶粉（混合有108mL-1的阪崎肠杆菌和长双歧杆菌）稀释成104～107mL-1的不同浓度梯度，分别取100 μL加入试纸条点样槽中，10～15 min后读取结果。

2 结果

2.1 抗志贺氏菌单克隆抗体的制备

超声波破碎后的志贺氏菌菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠，其抗血清效价如表2所示，约为640000左右。可以取脾脏用于单抗制备，经融合，筛选获得4株阳性融合细胞4E2、3E7、10H7、4G9，抗体类型均为IgG1a。

2.2 抗志贺氏菌单克隆抗体交叉反应的检测

表2 小鼠抗血清效价的测定

将25种菌株菌体分别点于膜上，取4G9单抗进行斑点杂交，结果如图1所示，除两株志贺氏菌（斑点1和斑点3）有反应外，与肠致病性大肠杆菌CMCC 44496（斑点11）有交叉反应，而与其他菌株均无反应。

1-25对应菌株参见表5。

2.3 多克隆抗体和单克隆抗体的配对

利用双抗夹心ELISA对兔多克隆抗体与4G9单克隆抗体进行配对检测，结果如表3所示，这两种抗体可同时用于制备胶体金试纸条。

表3 全菌抗原免疫所得多克隆抗体与单克隆抗体双抗夹心结果

2.4 胶体金标记抗体最佳pH值与检测线（T线）包被浓度的确定

当胶体金溶液pH值为7.5～8.5时为红色，所以选择pH 7.5再做细化实验，以确定标记时的最佳pH值。pH值为8.1时胶体金溶液红色保持最好。最终选择标记pH值为8.1。

当抗体添加量大于等于15 μg/mL胶体金溶液时，胶体金溶液可以保持原有的透亮酒红色。因此，15 μg即为稳定1 mL胶体金溶液需要的最小蛋白量。实际标记1 mL胶体金选择为18 μg抗体量。检测线多克隆抗体的喷涂浓度会影响T线显色情况。当多克隆抗体质量浓度小于1 g/L时，加入不同质量浓度梯度的宋内氏志贺氏菌（108～105mL-1），T线显色均随多克隆抗体质量浓度升高显色加深。而质量浓度大于1 g/L时，增大多克隆抗体喷涂浓度，肉眼下观察T线显色没有明显加深，结果如表4所示。因此本研究选择兔多克隆抗体以1 g/L和1 μL/cm喷涂T线。

2.5 试纸条特异性检测

将各测试菌株菌体稀释至108mL-1，与试纸条反应，发现只与宋内氏志贺氏菌ATCC 29930和福氏志贺氏菌ATCC 29903呈阳性反应，其他细菌和稀释液PBS均呈阴性反应，如表5所示。

表4 检测线条件优化

表5 试纸条特异性检测验证

2.6 试纸条灵敏度分析

用纯培养的宋内氏志贺氏菌用PBS稀释至不同梯度测定试纸条灵敏度，加样后3～15 min观察结果，结果显示，本研究制备的志贺氏菌胶体金快速检测试纸条的灵敏度为105mL-1，如图2所示。

图2中，1为无菌PBS缓冲液；2为LB液体培养基；3～6为含104～107mL-1宋内氏志贺氏菌的PBS缓冲液。

选取奶粉样品中常见的阪崎肠杆菌和长双歧杆菌混入5%的脱脂奶粉中，菌数调整为108mL-1，然后用于梯度稀释宋内氏志贺氏菌，加样10～15 min后观察结果，结果显示在牛奶样品中，相比对于菌体纯培物的检测灵敏度要低，灵敏度为106mL-1，结果如图3所示。

图3中，1为LB液体培养基；2为含杂菌（108mL-1阪崎肠杆菌和长双歧杆菌）的奶粉样本；3～6,含104～107mL-1宋内氏志贺氏菌的奶粉样本，同时含有108mL-1的阪崎肠杆菌和长双歧杆菌。

3 讨论

本文在制备了志贺氏菌单克隆抗体的基础上，首次探讨了志贺氏菌胶体金免疫试纸条在牛奶样品中应用的可能性，实验结果表明在奶粉样品中的检测灵敏度为106CFU/mL。

试纸条的灵敏度和特异性都与制备所用的两种抗体有密切的关系，抗体的亲和力、特异性以及抗原表位等都是影响试纸条品质的重要因素。因为所获得的单克隆抗体有较好的特异性，所以试纸条上的胶体金抗体对大多数的菌株不会结合显色。尽管该单克隆抗体与肠致病性大肠杆菌CMCC 44496有一定的交叉反应，但最后制备的试纸条表现出良好的特异性，并未出现对肠致病性大肠杆菌CMCC 44496的阳性反应，这与在试纸条T线喷涂的兔多抗有关。所用的抗志贺氏菌兔多抗经过免疫特异性逆向吸附，已除去了肠致病性大肠杆菌CMCC 44496的交叉抗体，故在T线上不能捕获肠致病性大肠杆菌CMCC 44496，所以最终试纸条上呈现阴性。如果想进一步提高试纸条的灵敏度可以从制备更好的抗体着手。

为了配合试纸条的应用，我们在融合细胞筛选过程中，选用活的志贺氏菌进行筛选，这样就可得到结合自然状态菌体表面的单克隆抗体，符合致病菌现场筛查的要求。现阶段对志贺氏菌检测一般都需要经过增菌步骤，有时还应用选择性培养基，本文制备的试纸条检测纯培养的志贺氏菌，灵敏度达到105mL-1，也能直接用于混有杂菌的牛奶样品中。鉴于目前实验室条件有限，还需获得更多的志贺氏菌用于进一步验证该方法的通用性。此外我们在市面上购买的所有奶粉样本都未发现有志贺氏菌的污染，所以我们用人工添加的志贺氏菌牛奶样本替代实际阳性样本进行检测。阪崎肠杆菌是婴幼儿奶粉中的常见污染菌，而长双歧杆菌又通常作为提高营养利用率的添加菌，故我们选取这两种菌作为杂菌添加到牛奶样品中，用于试纸条的检验。结果表明，不论杂菌，还是食品基质都不会干扰试纸条对志贺氏菌的特异性检测，结合试纸条在3～15 min内就可以快速完成检测的优点，说明试纸条比酶联免疫技术、放射免疫技术以及PCR技术有更广泛的适用范围，尤其是在基层和现场检测方面有着无可比拟的优点。

[1]KOTLOFF K L,WINICKOFF J P,IVANOFF B,et al.Global Burden of Shigella Infections:Implications for Vaccine Development and Implementation of Control Strategies[J].Bulletin of the World Health Organization,1999,77(8):651-656.

[2]黄宝华,陈庆森,庞广昌.志贺氏菌研究及其快速检测技术发展现状[J].食品科学,2004,25(11):333-336.

[3]KE X,GU B,PAN S Y,et al.Epidemiology and Molecular Mechanism of Integron-mediated Antibiotic Resistance in Shigella[J]. Archives of Microbiology,2011,193(11):767-774.

[4]中华人民共和国卫生部食品安全国家标准.GB/T 4789.5-2003食品微生物检验志贺氏菌检验[S].北京：中国标准出版社,2003.

[5]崔焕忠,张辉,王兴龙.单增李斯特菌单克隆抗体的制备及胶体金试纸的研制[J].中国兽医科学,2010,40(01):45-50.

[6]张建群,刘翔,杨扬,等.ELISA法测定氨苄青霉素用多克隆抗体的制备与鉴定[J].中国食品学报，2006,6(2):11-19.

[7]付连军,姜成,李沐森.猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用[J].畜牧兽医杂志，2011,30(3):17-19.

Development of colloidal gold based immunochromatographic strip test for detection of Shigella spp.in milk

XU Feng2,WU Xiao-li3,XU Di1,MING Xing1,WEI Hua1,2,LI Peng1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047，China；2.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang 330047，China;3 Basic Medical College，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004,China)

Monoclonal antibody againstShigellaspp.was produced in Balb/c mice using ultrasonicatedShigella sonneiand S.flexneri as immunogen.Indirect ELISA was employed for screening of monoclonal antibodies from fusion cells(spleen cells from Balb/c mice fused with myeloma cells).Four stable anti-Shigellaspp.monoclonal antibody producing hybridoma cell lines were screened out and one of which was labeled with colloidal gold for following studies.Polyclonal antibody againstShigellaspp.(rabbit source)and donkey-anti-mouse antibody were sprayed on the nitrocellulose membrane in line as test(T)and control(C)lines,respectively.The colloidal gold based immunochromatographic test strips for detection ofShigellaspp.were fabricated and tested with bacteria pure culture for their sensitivity and specificity.Results showed that the sensitivity of the strip was 105CFU/mL,and the test strip was specific to 2 Shigella strains with no cross reactivity with other 23 selected bacteria strains.The sensitivity of Shigella test strips was 106CFU/mL inEnterobacter sakazakiiandBifidobacterium longumspiking milk samples.The established colloidal gold based immunochromatographic strip test method is important for rapid and simple screening of Shigella spp.in food samples.

Shigella sonnei；Shigella flexneri；immunochromatographic strip；detection method

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0046-05

2011-12-30

国家自然科学基金项目（31000048）；（31170091）；（30900038）；江西省国际科技合作项目计划（2010EHA02200）。

徐锋（1977-），男，博士，从事益生菌的分子生物学研究。

黎鹏