嗜酸乳杆菌应用高质量分数脱脂乳的发酵工艺优化

粘靖祺，田芬，项丽丽，霍贵成

（1.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.光明乳业股份公司，上海 200000）

嗜酸乳杆菌应用高质量分数脱脂乳的发酵工艺优化

粘靖祺1，田芬1，项丽丽2，霍贵成1

（1.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.光明乳业股份公司，上海 200000）

将筛选出的嗜酸乳杆菌接种于25%的高质量分数脱脂乳中发酵,在单因素pH值、温度以及接种量试验的基础上，采用响应面法优化发酵工艺，获得高浓度的嗜酸乳杆菌活菌。结果表明：高质量分数25%脱脂乳培养基对菌株的生长有一定促进作用，得到高活菌数嗜酸乳杆菌的最佳发酵工艺为发酵pH值为5.81、发酵温度37.30℃、接种量3.18%，活菌数可达2.78×109mL-1。

嗜酸乳杆菌；高质量分数脱脂乳；发酵条件；响应面法

0 引言

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)广泛应用于发酵制品和膳食辅助材料中，是具有平衡人体胃肠道菌群、治疗腹泻、降低胆固醇和抑制有害菌等促健康作用的益生菌[1]，具有较高的开发价值[2]。脱脂乳是一种常用且易获取的发酵培养基原料，可供给乳酸菌生长所需的充足营养[3]，另外固形物量较大，具有良好的酸碱缓冲作用[4]。本实验通过对脱脂乳培养基浓度的调整、培养基营养因子的改良、发酵工艺参数的优化，使嗜酸乳杆菌达到高密度发酵。在工业化生产中，将含有高浓度脱脂乳的发酵液直接进行干燥处理，制备成活菌含量较高的益生菌粉，去除了其他培养基带来的多种工业化后处理的困难，不但缩减了成本，并且降低了发酵液染菌的概率[5]，为大规模产业化生产益生菌菌粉提供了一条实用的工艺路线。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株：嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU（东北农业大学乳品教育部重点实验室菌种保藏中心提供）。

材料与设备：MRS优化培养基；脱脂乳；KLF2000 3.7L发酵罐；电热恒温培养箱DHP-9272；HCl (0.01mol/L),NaOH（0.01mol/L）.

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌的传代、活化和计数

将筛选出的性能较好的嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU用质量分数为12%脱脂乳活化，于37℃恒温箱里培养24 h左右，活化3代；选择不同浓度的脱脂乳来进行发酵，活菌计数采用稀释倾注法。

1.2.2 单因素试验

质量分数为25%脱脂乳培养基灭菌条件：110℃，10 min，分别从葡萄糖添加量，pH值，接种量，温度4个单因素进行发酵实验[6]。以活菌数为指标，分别于14 h（该菌株的稳定期前期时间）取菌液测活菌数。

葡萄糖添加量分别为1%，2%，3%，4%（均为质量分数）；发酵pH值分别设为5.8，6.0，6.2，6.4；发酵温度分别设为30，34，37，40℃；接种量分别设为1%，2%，3%，4%。

1.2.3 响应面法优化嗜酸乳杆菌在高浓度发酵液的发酵条件

根据单因素实验结果，选取发酵pH值(x1)、发酵温度(x2)和接种量(x3)3个因素为自变量，以活菌数为响应值，进行中心组合试验设计。每个实验重复3次，取平均值，实验因素水平及编码如表1所示。

表1 实验因素水平编码表

1.2.4 模型的验证

通过响应面法优化嗜酸乳杆菌发酵高质量分数脱脂乳，取得高密度活菌，得出最佳工艺条件，并用验证实验来验证该模型的有效可行性。每个试验重复3次，取其平均值。采用Design Expert 7.1软件和Microsoft Excel 2003统计软件进行单因素方差分析、差异显著性分析和响应面分析[7]。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的比较

图1为嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU在不同浓度的脱脂乳培养基中的生长趋势。由图1可以看出，在4种不同质量分数的脱脂乳中，嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU的生长趋势较为接近，进入稳定期的时间均为14 h，相比其他质量分数，在质量分数为25%脱脂乳中生长的嗜酸乳杆菌活菌数最高，可能原因为质量分数高的脱脂乳中固形物含量较高，故营养物质含量充足，可更好的满足该菌株生长。相较于其他3种质量分数脱脂乳，质量分数为25%脱脂乳中的生长趋势较为平缓。可能是由于较高质量分数的脱脂乳对产生的乳酸有一定的缓冲能力，降低了因发酵液环境中的局部酸度过高而抑制嗜酸乳杆菌生长的情况。将嗜酸乳杆菌接种于大于质量分数25%的脱脂乳中生长的趋势及活菌数基本一致。因此，本研究选用质量分数为25%的脱脂乳作为培养基。工业发酵一般采用质量分数为10%～12%的脱脂乳发酵乳酸菌[4]，下游中再添加质量分数为12%的脱脂乳作为保护剂进行喷雾干燥。本实验为避免分批分步添加脱脂乳的工艺繁琐，多次添加辅料造成工艺染杂菌的情况，同时可降低成本，故一次性添加25%脱脂乳作为培养基，达到了更好的优化工业发酵条件的效果。

2.2 单因素实验

根据乳酸菌利用糖代谢的方式，其优先利用葡萄糖作为碳源[8]，为使嗜酸乳杆菌的稳定期提前，尝试在培养基中添加不同梯度的葡萄糖与未添加葡萄糖，比较嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU在不同培养基中生长趋势的差异，结果如图2所示。由图2可以看出，得到在12 h时活菌数的明显差异。另外，有文献报道添加益生元对嗜酸乳杆菌的生长有促进作用[9-10]，但本研究添加果糖和菊粉后[11-12]，活菌提升变化不明显，可能是本研究筛选的菌株更偏爱于吸收葡萄糖，另外高质量分数的脱脂乳培养基中提供给微生物生长所需的营养成分充足，因此不再另外添加营养因子。

如图2所示，添加葡萄量为2%时，活菌数达到最大，所以在单因素试验以及响应面优化中，都均向质量分数为25%脱脂乳中添加2%的葡萄糖作为培养基进行实验，其进入稳定期时间从原来的14 h提前到12 h，单因素实验的活菌数都是在14 h下测定的。

图3为pH值对活菌数的影响。如图3可以看出，pH值变化对高浓度培养基中嗜酸乳杆菌的活菌数影响明显。为了降低pH值到5.6，加入的HCl过多导致酪蛋白沉淀，不利于菌种通过代谢蛋白进行繁殖，从而抑制了菌株生长，当发酵pH值为5.8时，活菌数达到最大，随发酵pH值继续增加，活菌数呈逐渐下降趋势，嗜酸乳杆菌比较偏向于酸性环境，pH值的继续升高对其生长不利[13]。

图4为接种量对活菌数的影响。如图4可以看出，随时接种量的增加，活菌数呈上升趋势，在接种量3%时嗜酸乳杆菌活菌数KLDS AD3-SU的活菌数最高，当接种量达到4%时，活菌数降低，可能是由于初期菌体产生的乳酸过多，反而抑制了活菌数的增加。因此接种量选择3%为宜。

图5为温度对活菌数的影响。如图5可以看出，发酵温度[14]的对嗜酸乳杆菌的活菌数影响显著。从30℃到37℃，随着温度上升，活菌数也相应提高，达到37℃时，活菌数最高，随后活菌数随发酵温度的升高呈逐渐下降趋势。说明37℃是该菌最适宜生长的温度，该菌的耐热性差，温度过高反而抑制其生长。

2.3 响应面模型的建立及其显著性

根据上面单因素试验的结果,通过Design Expert7.1软件对培养条件设计了3因素3水平试验,所得数据分析结果如表2所示。

然后对上述回归模型进行方差分析，结果如表3所示。结果表明：交互项pH值与温度、pH值与接种量对活菌数的影响不显著，各单因素及温度和接种量交互作用对活菌数的影响均显著（P＜0.05），失拟项不显著，回归模型的决定系数为0.9905，说明该模型能够解释99.05%的变化，该模型拟合程度良好，试验误差小，因此，可用此模型对嗜酸乳杆菌在高浓度脱脂乳中发酵的发酵条件进行分析和预测。

表2 响应面实验设计方案及结果

表3 响应面回归模型的方差分析

比较F值可知，3因素对嗜酸乳杆菌的活菌数影响大小依次为：接种量＞pH值＞发酵温度。并且3个因素的影响均为极显著（P＜0.01）。利用Design Expert软件，对表2的数据进行回归拟合分析，可得到响应值活菌数对数y对编码自变量x1、x2和x3的回归方程为

对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面分别如图6～图8所示。

由图6可以看出，两个因素的交互项不显著，由响应面可以看出，接种量值不变，活菌数随温度和pH值的增加而迅速增加，当温度为37～37.5℃时，活菌数最高。pH值在5.7～5.9范围内，活菌数较高。

由图7可以看出，两个因素的交互项也不显著，由响应面可以看出，温度不变，活菌数随pH的升高而逐渐增加，当pH值超过5.9时，活菌数降低。同样的，由图8可以看出，发酵温度在30～37℃，接种量在2.5%～3.8%范围内，活菌数较高。相关研究表明，在较低的pH值培养的乳酸菌菌存活率高，而在最适pH值的菌存活率低[15]，因此在生产嗜酸乳杆菌活菌制品时，可考虑在一定范围内降低pH值，以延长存活期。

2.4 最优条件的确定

通过上述回归模型，采用Design-Expert 7.1软件优化发酵条件，获得嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU在高质量分数脱脂乳中的最适发酵条件为：发酵pH值5.81，发酵温度37.30℃，接种量3.18%，在此条件下活菌数（对数值）为9.44289 mL-1，即2.78×109mL-1。采用上述条件进行实际的验证，经过3次重复实验得到活菌数的平均值为3.12×109mL-1，试验值与分析值的相对误差为0.5%，较优化前提高的36.19%。证明采用响应面法优化得到的发酵条件准确可靠具有实用价值。

3 结论

通过数据分析及响应面法对嗜酸乳杆菌在高浓度的脱脂乳中发酵条件进行了优化，在质量分数为25%的脱脂乳培养家中添加质量分数为2%的葡萄糖，并得到嗜酸乳杆菌KLDS AD3-SU最优发酵条件。在以后的研究中应根据以上结论再对冻干条件和喷干进出口温度的控制进行探索,以提高该菌的存活率。本实验针对中小型企业提供了一种方便快捷的生产直投式发酵剂的方法，根据本课题研究思路可对其他乳酸菌的工业扩大生产，提供了便利的前提条件。

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Optimized the high mass fraction Fermentation Conditions for Lactobacillus acidophilus

NIAN Jing-qi1，TIAN Fen1，XIANG Li-li2,HUO Gui-cheng1
(1.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China, 2.Bright Dairy&Food Co.,Ltd Shanghai 200000,China)

Using response surface methodology(RSM)for optimized the fermentation conditions for Lactobacillus acidophilus,high mass fraction of skimmed milk was used as the medium,based on the single factor tests of fermentation pH,fermentation temperature and inoculation amount.Results suggested that contain 25%of the high mass fraction of skimmed milk can partly promote the growth of Lactobacillus acidophilus,the optimal culture conditions:pH 5.8,inoculation amount of 3.18%and fermentation temperature of 37.30℃.the viables could reach 2.78×109cfu/ml.

Lactobacillus acidophilus;high mass fraction of skimmed milk;technical condition optimization;response surface method

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0034-04

2012-12-07

“乳酸菌代谢调控与发酵剂制造技术”教育部长江学者和创新团队发展计划资助（IRT0959）。

粘靖祺（1987-），女，硕士，研究方向为乳品科学与微生物。

霍贵成