高效液相色谱测定广西生鲜乳中的维生素A

段玉林,苏骏,吴雪,张少梅,温韬,梁梦宇,陈小聪,蒙泳,周曼,宗玉英

（1.广西产品质量监督检验院,南宁 530022;2广西壮族自治区质量技术监督局南宁 530022;3广西壮族自治区环境监测中心站,南宁 530022）

高效液相色谱测定广西生鲜乳中的维生素A

段玉林1,苏骏1,吴雪1,张少梅3,温韬1,梁梦宇1,陈小聪1,蒙泳2,周曼1,宗玉英1

（1.广西产品质量监督检验院,南宁 530022;2广西壮族自治区质量技术监督局南宁 530022;3广西壮族自治区环境监测中心站,南宁 530022）

为了建立生鲜乳中维生素A的一种快速、准确、灵敏度高的检测方法，样品经皂化后，经石油醚提取，浓缩后采用高效液相色谱法，以Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温35℃，检测波长325 nm，流动相为甲醇∶水（98∶2，体积比），流速1.0 mL/min的条件进行实验。结果维生素A在0.174～87.2 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.9999，平均回收率为98.17%，RSD=1.90%。建立的方法准确、可靠，可以用于生鲜乳中维生素A的含量检测。

生鲜乳；维生素A；高效液相色谱

0 引言

维生素A属于脂溶性维生素，能够调节人体的多种生理机能，增强机体免疫能力，在调节体内各方面的代谢及促进骨骼的生长发育上有着极其重要的作用[1]，同时它也参与视网膜视紫质的合成与再生，维持正常视觉，因此常被用作营养素加入到食品中，特别是婴幼儿食品中。但维生素A进入机体后排泄效率不高，长期过量摄入可在人体内蓄积，引起维生素A过多症，成年人长期摄入15 000 μg视黄醇当量，即可出现厌食、过度激动、恶心、呕吐、眼底水肿等中毒症状[2，3-5]。而在市售的乳制品中，维生素的标示存在标示量与实际测量值相差悬殊、更有甚者不标维生素A的含量等问题，如果长期食用这类食品，必然给消费者健康造成危害。

1 实验

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器为日本岛津LC-20AT液相色谱仪。主要试剂：视黄醇标准品(纯度在99.5%以上)，甲醇（色谱纯），乙醇（色谱纯），水（超级纯），石油醚（沸程30℃-60℃），氢氧化钾（分析纯），抗坏血酸（分析纯），无水硫酸钠（分析纯），生鲜乳。

1.2 色谱条件

岛津Shim-pack VP-ODS柱子（4.6mm×150mm，5 μm），流动相为甲醇∶水（98∶2，体积比）。检测波长325 nm，柱温35℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。

1.3 标准品溶液的配制

称取适量的视黄醇标准品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中作为标准储备液。移取20 μL标准储备液，用乙醇定容至10 mL，用325 nm波长、1 cm比色皿测得其平均吸光值为0.032，计算[6]出其标准储备液中视黄醇的浓度为87.2 μg/mL。分别准确吸取视黄醇的标准品储备液0，0.1，1，5，10，20，25，50 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度摇匀，得标准系列工作液质量浓度分别是0.174，1.74，8.72，17.44，34.88，43.60，87.2 mg/L。

1.4 样品处理

称取摇匀后的试样约50 g（精确至0.1 mg）至250 mL三角瓶中，加入100 mL抗坏血酸的乙醇溶液（质量浓度15 g/L），摇匀后加入25 mL氢氧化钾的水溶液（质量浓度1 250 g/L），放在恒温磁力搅拌器（水温控制在53℃）上皂化45 min；冷却后用石油醚反复提取皂化液，用水洗至中性后，将用无水硫酸钠脱水后的提取液减压蒸至近干，用氮气吹干后加入5 mL甲醇溶解，经0.45 μm滤膜过滤后备用。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法

维生素A是一种不稳定的有机化合物，受贮存时间、温度、光照等因素影响较大[7]，这对维生素A的测定带来一定的难度，所以在样品前处理时要采取避光、缩短做样时间等措施以提高其测量准确度。本方法较国家标准[GB5413.9-2010]中减少了提取液蒸干后定容分取步骤，提取液蒸至近干后直接用氮气吹干，再加甲醇直接溶解，这样不但简化了样品处理步骤，节省了试验时间，同时也避免了定容分取引起的测量误差。为了比对采用不同标准的处理方法[6，8]而引起的测量差别，笔者采用同一生鲜乳进行了如下实验：

表1 不同条件下测定生鲜乳中的维生素A测量结果μg/100g

由表1可以看出，沸水浴回流皂化程度较完全，萃取时采用注射器抽取可降低使用分液漏斗时的萃取液损失，减少测定误差，由此我们可以在测量维生素A采取沸水浴回流皂化、注射器抽取分液的样品处理措施。改进后方法较国标方法测量准确度更高，同时此方法作为非标方法也可以缩短检验时间，提高检测效率，在检测机构中作为非标方法可以推广使用。

2.2 检测波长与流动相的选择

视黄醇在325 nm处有比较强的吸收[8]，测定维生素A时检测波长选325 nm；流动相甲醇中加入水后分离程度较好，但分析时间加长，本文用甲醇：水（98:2，体积比）作流动相[1，8，9]。

2.3 线性关系及仪器检出限

取质量浓度为0.174，1.74，8.72，17.44，34.88，43.60，87.2 mg/L系列溶液，分别进样10 μL，记录色谱峰峰面积，以峰面积与浓度作线性回归，得色谱条件下维生素A的线性回归方程为Y=81912X-11937，r= 0.9999。图3结果表明，维生素A在0.174～87.2 mg/L质量浓度范围内色谱峰面积与质量浓度之间具有较好的线性关系，以信噪比为3时测得最低检出限量为1.88×10-9μg（响应值N=5×10-3，以峰面积为纵坐标，以维生素A的质量分数为横坐标得Y=8×106X-6502.3，b=8×106，检出限为3 N/b）。不断地稀释标准品溶液，当质量浓度稀释到0.05 μg/L时还有检测信号，再向下稀释时信号不明显，得出该方法的最低检出限为0.05 μg/L。

2.4 准确度实验

取质量浓度为87.2 mg/L的标准品溶液连续重复进样6次，每次进10 μL，测得峰面积值的平均值为7140345，RSD=0.10%（表2）。

表2 准确度实验

2.5 加标回收率实验

取质量浓度为87.2 mg/L的标液1 mL，加入到50.00 g空白样品中（该样品的维生素A 3次测定后平均值为45.8 μg/100 g，造化提取后过0.45 μm滤膜，平行测定5次，得其标准平均回收率为98.17%，RSD= 1.90%。

表3 回收率实验

2.6 水牛与花白牛产的生鲜乳中维生素A的比较

为了掌握生鲜乳中维生素A的质量分数区别，笔者就广西不同牧场的水牛及花白奶牛所产的生鲜乳进行连续3 d的测定，测定结果如表4所示。

表4 生鲜乳中维生素A的测定μg/100g

由表4可以看出，同一头奶牛所产的生鲜乳中维生素A的含量是稳定的；整体上水牛所产的生鲜乳中比花白牛的高，由于个体差异，个别花白牛也有比水牛的高；由于农户散养的水牛在饲料及其他条件上比牧场饲养的条件好，所产的生鲜乳中维生素A质量分数就较高，综上可以看出，生鲜乳中维生素A的含量高低不但同奶牛的品种有关，也与奶牛的饲养条件密切相关，同时又存在奶牛个体之间的个体差异。

3 结束语

本实验采用高效液相色谱作为生鲜乳中维生素A的检测方法，经过对国家标准方法[7-8]稍作改动，有利于节约试验时间，提高测量的准确度，作为非标方法可以在食品检测机构中推广应用，对乳制品中维生素A的准确测量将能起到积极的作用。

通过对广西不同牧场不同品种及不同饲养条件下的奶牛连续进行维生素A的测定，可以看出生鲜乳中维生素A的含量不但是有奶牛的品种所决定，更于奶牛的饲养条件有着很大的关系，同时也存在着奶牛的个体差异，这将对今后的奶牛的选种培育、优化奶牛养殖具有重要的指导意思。

[1]陈春晓，刘红河，康莉，等.强化食品中维生素A和维生素E的反相高效液相色谱同时测定法[J].职业与健康,2005,21(8)：1130-1132.

[2]郭建辉，刘安军，刘有志，等.高效液相法测定鹅肥肝和鹅肝酱中维生素A[J].食品研究与开发，2006,10，119-121.

[3]李婷欣,李云.维生素A对免疫功能的影响[J].生命的化学,2005,(01): 59-61.

[4]宋圃菊.中国儿童临床维生素A缺乏[C].量营养素与儿童健康学术研讨会论文汇编，2004.

[5]李婷欣，李云.维生素A对免疫功能的影响[J].生命的科学,2005,25(1): 56-58.

[6]中华人民共和国国家标准GB 54139-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定[S].中华人民共和国卫生部发布，2010.

[7]关尔吉.高压液相色谱法测定饲料添加剂多种维生素中维生素A和维生素E含量[J].兽医药品通讯，1987(1)：37-41.

[8]李东，蒋淑梅，袁秀娟.维生素A分析方法的研究进展[J].中国食品添加剂，1999,2,28-32.

[9]赵慧芬，李克杰，曹燕叔，等.高效液相色谱法同时测定强化牛奶中的维生素A和D2[J].色谱，1995,13（1）：61-62.

Detection of Vitamin A in the Gungxi fresh milk by performance liquid chromatography

DUAN Yu-lin1，SU Jun1，WU Xue1，ZHANG Shao-mei3，WEN Tao1，LIANG Meng-yu1，CHEN Xiao-cong1，MENG Yong2，ZHOU Man1，ZONG Yu-ying1
(1.Guanxi Product Quality Supervision and Testing Institute,Nanning 530022,China;2.Guangxi Bureau of Quality and Technical Supervision，Nanning 530022,China;3.Guangxi Environmental Protection Monitoring Central Station,Nanning 530022，China)

To establish a quick,accurate,sensitive method for analyzing Vitamin A illegally added into the fresh milk.The sample was determined after being saponified,abstracted with petroleum ether and concentrated,performance liquid chromatography was used.The column was Shim-pack VP-ODS 4.6×150 mm,column temperature was 35℃and the mobile phase was methanol:water=98:2(v:v)with flow rate 1.0 mL/min and the detective wavelength was 325 nm..The linear range of the calibrati on curve of Vitamin A were 0.174～87.2 μg/mL (r=0.9999).The mean rates of recovery was 98.17%and the relative standard deviations(n=5)was 1.90%.The method is accurate,realiable that can be used to determine Vitamin A in the fresh milk.

fresh milk；Vitamin A；performance liquid chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0058-03

2011-11-30

段玉林（1982-）,男，硕士研究生，研究方向为食品化工产品分析。