李景文 王锡山
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。在我国发病率很高,40%~50%接受结直肠癌切除的患者死于肿瘤复发和转移[1]。常见的远处转移器官为肝脏,其次为肺、骨、脑,而卵巢转移相对较少见,同时性卵巢转移癌的发生率为3.6%~7.4%,异时性卵巢转移癌的发生率约1.5%[2]。虽然卵巢转移癌的发生率较低,但一旦发生卵巢转移就意味着晚期,疾病进展较快,预后较差,所以了解肠源性卵巢转移癌的分子机制至关重要。
B细胞特异单克隆白血病毒整合位点1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1),Bmi-1是首个被报道与癌症生长有关的PcG基因。Bmi-1作为原癌基因与c-myc共同作用,促进细胞转化和肿瘤形成,并直接参与干细胞的自我更新[3]。近年来在胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌以及部分血液系统恶性疾病中均发现Bmi-1的异常表达[4-9],而关于肠源性卵巢转移癌的报道甚少。本研究通过免疫组织化学染色,检测Bmi-1蛋白在正常肠黏膜、结直肠癌、肠源性卵巢转移癌中的表达,探讨Bmi-1与结直肠癌临床病理因素的关系、临床意义及其在卵巢转移过程中的作用。
从2010年4月到2011年7月收集哈尔滨医科大学附属第三医院结直肠外科手术切除的肠源性卵巢转移癌患者44例及配对正常黏膜20例和原发灶25例。年龄(51.0±11.3)岁,其中同时性转移者15例,异时性转移者29例,伴淋巴结转移者29例,不伴淋巴结转移者15例,44例患者均无其他远隔脏器转移。
标本均经10%福马林固定,常规石蜡包埋。将44例配对的标本行常规4 μm连续组织切片,固定于经1 g/L多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上,60℃连续烤片7 h,常温保存备用。采用pv-9003法(pv-9003试剂盒购自北京中杉公司)进行免疫组织化学染色,切片使用柠檬酸修复液修复和过氧化氢封闭后滴加一抗,4℃过夜,次日滴加pv-9003试剂盒中试剂A和B,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片,用PBS代替一抗作阴性对照。
Bmi-1蛋白阳性表达为细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒。本研究采用IRS综合评分的方式,高倍镜下随机取2个不同视野,计数细胞总数及核阳性细胞数,按照阳性细胞所占百分比,阴性表达为0分;阳性率:1%~10%为1分,11%~30%为2分,31%~50%为3分,51%~80%为4分,>80%为5分。再根据染色强度计分,阴性为0分,弱染色为1分,中度染色为2分,强染色为3分,将每张切片平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分各自相乘,为IRS最终得分:0分为阴性,1~5分为低表达(+),6~10分为中度表达(++),>10为高度表达(+++)。
所有数据用SPSS 13.0软件进行统计学处理,Bmi-1与患者生存期关系采用两独立样本t检验,Bmi-1与结直肠癌临床病理因素的关系采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
Bmi-1在直肠癌原发灶中的表达阳性率显著高于正常黏膜中的表达(分别为65.9%、15.9%,χ2=22.752,P<0.01);Bmi-1在卵巢转移癌中表达的阳性率与正常黏膜相比差异无统计学意义(13.6%、15.9%,χ2=0.090,P=0.764)。Bmi-1在直肠癌原发灶中的表达,对于以下影响因素有明显统计学差异(表1):结直肠癌的病理类型(χ2=5.116,P<0.05)、术前T分期(χ2=4.856,P<0.05)、术前N分期(χ2=5.495,P<0.05)。而对于以下影响因素无明显示统计学差异:患者的年龄(χ2=0.030,P>0.05)、是否绝经(χ2=1.349,P>0.05)、原发灶部位(χ2=0.271,P>0.05)、肿瘤大小(χ2=0.024,P>0.05)、卵巢转移的时间(χ2=0.004,P>0.05)。同时在本研究发现Bmi-1异常表达的患者平均生存期为13.16个月,明显低于无Bmi-1异常表达者的16.87个月,差异有统计学意义(t=-2.524,P=0.012)。
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一。据国内流行病学调查资料显示,其发病率排在第3位,仅次于肺癌及乳腺癌,而死亡率已居第4位。它是一个多因素、多步骤逐渐演变的过程,现认为其与主要多基因联合失调有关[10]。肠癌远处转移最常见的器官为肝脏,卵巢转移的发生率为1.4%~25%,平均约为7%[11]。Bmi-1可能参与大肠癌的发生发展以及淋巴结的转移[10,12-14].
Bmi-1作为一个原癌基因c-myc共同参与小鼠T、B细胞淋巴瘤的发生。Bmi-1基因定位于10号染色体短臂1区3带(10p13),含10个外显子,其cDNA长为3 203 bp,其开放阅读框编码一种326个氨基酸的蛋白,相对分子量为4.4×104~4.6×104[15]。Bmi-1蛋白含有几个重要的结构域:(1)位于N-末端的环指结构(ring finger domin,R),该结构域保证Bmi-1蛋白均匀分布在细胞核边缘易染色质集中的区域是发挥转录抑制作用的限制性因素;(2)位于中区域的重复螺旋-转角-螺旋-转角-螺旋-转角结构(HTHTHT结构域),介导Bmi-1蛋白与DNA的结合;(3)2个核定位信号KRRM和KRMK序列;(4)位于C-末端的富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的PEST区域,该结构与Bmi-1蛋白在细胞内迅速降解有关[16]。Bmi-1通过抑制编码两种肿瘤抑制因子P16和P19(在人类中是P14)的INK4a-ARF来诱导生长停滞、细胞衰老和凋亡。
表1 Bmi-1蛋白与结直肠癌临床病理因素的关系
注:a为Fisher确切概率法
本研究发现在结直肠癌原发灶中的Bmi-1的表达水平显著高于正常黏膜,Bmi-1在原发灶中的高表达与结直肠癌的病理类型、分期及淋巴结转移相关,提示Bmi-1不仅参与结直肠癌的发生、发展,同时可能也参与淋巴结的转移,这与国内外许多报道的结果一致。Bmi-1在许多癌灶中存在异常表达,其中就包括结直肠癌、卵巢癌,同时有报道,在shRNA水平下调Bmi-1可以抑制肺腺癌细胞的迁移和转移[8],提示Bmi-1不仅是参与恶性肿瘤的发生、发展,同时也参与恶性肿瘤的转移,但是本研究未发现Bmi-1在卵巢转移灶中存在异常表达的现象,提示Bmi-1在大肠癌卵巢转移过程中发挥的作用及作用的机制可能与肿瘤转移基因的作用机制有所不同。虽然现已明确Bmi-1与P16INK4a和P14ARF抑制因子有关,在结直肠癌中P16INK4a和P14ARF的缺失可能通过该基因5’、CpG岛异常甲基化或同源混合性缺失和基因突变的机制被诱导,但是Bmi-1在细胞周期调控中不同的凋亡机制、其在不同微环境中的作用机制以及其是否具有肿瘤转移基因的作用仍有待于进一步研究。本研究发现Bmi-1在大肠癌卵巢移灶中未见异常表达,但是在原发灶中表达明显增高,且这部分患者的生存期明显缩短,说明Bmi-1与伴有卵巢转移的大肠癌患者的预后相关,可能是结直肠癌重要预后相关因子。
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