比较四种消化方法对神经干细胞传代增殖及活性的影响

程春凤,杨 智,李 壮,黄昕艳,江清林

(1.佳木斯大学附属第二医院神经内科,黑龙江佳木斯154002;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯154003;3.佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)

比较四种消化方法对神经干细胞传代增殖及活性的影响

程春凤1,杨 智1,李 壮2,黄昕艳1,江清林3

(1.佳木斯大学附属第二医院神经内科,黑龙江佳木斯154002;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯154003;3.佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)

目的:观察4种消化方法对体外培养的神经干细胞(NSCs)增殖及活性的影响。方法:原代培养新生大鼠海马NSCs,采用机械消化、0.25%单纯胰酶、0.25%胰酶+0.02%EDTA 和0.02%EDTA 4种不同消化方法对NSCs球进行传代培养,经四唑盐比色法(MTT法)法检测不同方法对NSCs活性及增殖能力的变化。结果:与机械消化相比,0.25%单纯胰酶组,0.25%胰酶+EDTA组消化后的大鼠海马NSCs球长时间不聚集,细胞增殖停顿,而单纯EDTA组则明显提高了NSCs的增殖及活性,其余各组差异无统计学意义。结论:随培养时间延长,单纯0.02%EDTA组能够显著提高体外培养的大鼠海马NSCs的增殖水平及活力,且对细胞的后续损伤相对较小。

神经干细胞;原代培养;胰酶;EDTA;MTT法

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞,它的发现是神经科学领域的重大进展,彻底改变了以往认为中枢神经不能再生的认识,为神经发育研究与神经组织移植开辟了广阔的前景。因NSCs具有多向分化潜能,决定了它在神经系统修复治疗中,可以通过NSCs移植或体内激活,分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起,成为治疗脑脊髓损伤和神经系统退行性病如阿尔茨海默病、帕金森病等最为理想的原材料[1,2]。为此,前人对神经干细胞体外培养及促进其增殖方面作出了大量不懈的努力[3,4],本研究对NSCs传代培养时的传统消化方法进行改良,细胞活力明显增强并得到了较高的得率。

1 材料

1.1 实验动物

新生24h以内Wistar大鼠,由佳木斯大学动物中心提供[实验动物许可证号:SYXK(黑)2006-004]。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM/F12干粉培养基、B27添加剂、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司;大鼠基因重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)购于美国Pepro Tech公司;青霉素及链霉素购于哈药总厂;0.25%单纯胰酶、0.02%EDTA和0.25%胰酶+0.02%EDTA混合液、台盼蓝、噻唑兰(MTT)购于美国Sigma公司、Nestin、NSE、GFAP一抗购于北京博奥森公司;Cy3二抗、大鼠SABC大鼠试剂盒、DHanks液、PBS液、4%多聚甲醛购于武汉博士德公司;CO2恒温培养箱(美国Sheldon公司);XSZ-D型相差倒置显微镜(日本O lympus公司)。

2 方法

2.1 NSCs原代培养

常规分离新生Wistar大鼠海马,D-Hanks液漂洗,充分剪碎,用吸管吹打成单细胞悬液,以5×105/L密度接种于培养瓶中,加入NSCs完全培养液(含DMEM/F12、bFGF、EGF、B27和青链双抗)再次制成细胞悬液,台盘兰染色计数后以1×106/mL密度接种于25cm2培养瓶中,37℃,5%CO2孵箱中培养,3d后离心、半量换液,继续培养到第7d,待形成大量100～200个细胞左右的NSCs球时,进行消化传代。

2.2 NSCs分组消化和传代培养

将培养瓶中NSCs调整为5×105个/mL接种于4个小离心管中,每管接种1mL。实验分为4个组:A组为单纯机械吹打组,B组为为0.25%胰酶组,C组0.25%胰酶+EDTA组,D组为0.02%EDTA组。A组各孔用尖头吸管反复吹打5min;B-D组各孔分别加入等体积的消化液后37℃孵育5min,中间用尖头吸管吹打2～3次,含胰酶组用血清终止消化,最后将4管细胞悬液全部离心弃上清,再用完全培养液重悬。

2.3 MTT法检测各组NSCs活性

将2.2中4组NSCs重悬液,以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μL,37℃ 5%CO2孵箱中继续培养。每天连续观察各组NSCs增殖数量及细胞状态,连续计数7d后绘制生长曲线。分别于培养3d、5d和7d三个时间点MTT法检测细胞活力(8孔/组·时间点),具体方法:向每孔加入MTT溶液20μL,37℃继续孵育4h后终止培养,将孔内细胞离心收集(1000r/min 5min),每孔加入150μLDMSO,震荡10min,用酶标仪在570nm波长处测定每孔吸光值(A值)。取每组消化方法8孔的吸光值均数,试验重复三次,计算其平均值。计算细胞存活率(%)=T/D×100%(T和D分别为测定孔何对照孔细胞的光密度平均值)。

2.4 统计学处理

应用SPSS16.0软件包进行统计学处理,计量资料采用±s表示,组间比较采用t检验,P＜ 0.05为差异有显著性。

3 结果

3.1 NSCs原代培养

倒置显微镜下观察原代培养海马NSCs单细胞悬浮生长,密度较均匀,基本无贴壁现象(见图1-A);24h后发现NSCs克隆,以后克隆逐渐增大(见图1-B);到第3天聚集成圆球形,漂浮生长于培养瓶中,折光性好,大小不等(见图1-C);到第7天克隆到数百个细胞,形成所谓的神经球。此刻的神经球立体感及折光性均强,边界清晰。组成神经球的细胞圆润饱满,活力状态好(见图1-D)。

3.2 N SC分组消化和传代培养

不同消化方法传代结果显示:单纯0.02%EDTA组较机械消化组细胞球容易吹打开,且细胞多为大小均匀一致的小细胞球;单纯机械消化后细胞球直径大小差异大,小细胞球被吹打为单细胞时,大直径细胞球仍未吹打开;0.25%胰酶组及0.25%的胰酶+0.02%EDTA组消化时间及程度难以掌握,消化后单细胞较多,且长时间不聚集,细胞增殖停顿。由细胞生长曲线(见图2)及MTT检测结果(见表1)显示单纯0.02%EDTA组神经干细胞的活力好于其余三组,细胞数目逐渐增多。传代后1～3d细胞增殖数差别不大,随培养时间延长,各组细胞增殖数差别显著,单纯0.02%EDTA组对细胞的后续损伤相对较小。

图1 NSCs原代培养(200×)

图2 不同消化传代方法NSCs生长曲线

表1 不同消化传代方法NSCs存活率 (±s,n=8)

表1 不同消化传代方法NSCs存活率 (±s,n=8)

注:与机械消化组比较,＊、＊＊、＊＊＊P＜ 0.05;其余组间比较无统计学差异。

?

4 讨论

在NSCs原代培养传代有机械消化和胰酶消化两大类方法,我们在实验中发现,机械消化法可以得到杂质比较少的单细胞悬液,对细胞的损伤程度较小,但在遇到NSCs球直径较大时,机械消化法效果不理想,难以将细胞球吹打开。我们选用0.25%胰酶和0.02%EDTA进行消化,其作用机理:EDTA是一种螯合剂,因为细胞表面很多相互结合的蛋白都是带有钙离子或镁离子的蛋白,而EDTA可以螯合钙离子或者镁离子,从而加速细胞间相脱离。胰酶是一种蛋白酶,在特定的位置降解蛋白,可以将细胞膜上相互结合的蛋白降解,从而使细胞与细胞分离,缺点是消化的时间和程度很难掌握,消化过度的话细胞长时间呈单细胞悬液状态,很难聚集,且接近无增殖状态,此种现象是细胞膜受损所致。为了细胞能更好的生长,我们试图寻找更好的消化方法,在本实验中我们把NSCs分为机械消化组,0.25%胰酶+EDTA组,0.25%胰酶组,0.02%EDTA组。细胞生长曲线及MTT检测结果显示单纯0.02%EDTA组NSCs活力好于其余三组,细胞数目逐渐增多。免疫荧光及免疫细胞化学染色显示,神经干细胞球中几乎所有细胞呈nestin阳性表达。

[1]朱晓峰,董为伟.神经干细胞特性及其在神经疾病中的应用[J].中华神经科杂志,2001,34(4):248-249

[2]Gross C G.Neurogenesis in the adult brain:death of a dogma[J].Nat Rev Neurosci,2000,1(1):67-73

[3]顾恩妍,哈福,李林风,等.神经干细胞分离培养方法介绍[J].中国比较医学杂志,2008,18(11):53-57

[4]李峰,刘玉光,朱树干,等.机械分离与胰酶消化分离对长期培养的神经干细胞神经发生能力的影响[J].山东医药,2008,48(21):22-25

Compare the effect of four kinds of digestion methods to the proliferation and activity of the neural stemcell passage

CHENG Chun-feng1,YANG Zhi1,LI Zhuang2,HUANG Xin-yan1,JIANG Qing-lin3
(1.Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China;2.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;3.Jiamusi Basic Medical University,Jiamusi 154007,China)

Objective:To observe the four kinds of digestion of NSCs in vitro proliferation and activity.Methods:Primary culture of neonatal Wistar rat hippocampal NSCs,mechanical separation,0.25%pure trypsin,0.02% EDTA and 0.25% trypsin+0.02% EDTA 4 different digestion methods NSCs ball subculture,the four methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT)method for detection of four kinds of digestive activity and proliferation of NSCs changes.Results:Compared with the mechanical digestion,0.25%trypsin alone group,0.25%trypsin+EDTA group after digestion in rat hippocampalNSCs do not gather the ball for a long time,cell proliferation stopped,and proliferation of NSCs and activity were significantly increased by pure EDTA group,which makes no significant difference in the other groups.Conclusion:With the cultivate time extended,pure 0.02%EDTA group can significantly improve the in vitro proliferation of hippocampal NSCs level and vitality,and the subsequent damage to the cells is relatively small.

neural stem cells;primary cultivate;trypsin;EDTA;MTT method

Q 25;R329.2+7

A

1008-0104(2012)02-0001-02

2011-01-06)

黑龙江省研究生创新科研项目,编号:YJSCX2011-387HLJ;黑龙省卫生厅科研项目,编号:2010-531;黑龙江省教育厅科研项目,编号:12521543。

程春凤(1963～)女,黑龙江海伦人,主任医师,教授,硕士生导师,研究方向为神经干细胞基础与应用。

江清林(1964～)男,黑龙江林口人,硕士,研究员,研究生导师。E-mail:hljyykx@163.com。