天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究

郑斯竹 ，安榆林 ，徐 梅 ，杨晓军 ，常 虹 ，嵇保中

（1. 南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037；2. 江苏出入境检验检疫局植物检疫实验室，江苏 南京 210001）

天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究

郑斯竹1，安榆林2，徐 梅2，杨晓军2，常 虹1，嵇保中1

（1. 南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037；2. 江苏出入境检验检疫局植物检疫实验室，江苏 南京 210001）

为了开展天牛科昆虫分子系统学研究，采用酚-氯仿提取法、TakaraDNA快速提取试剂盒及GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒3种方法分别对75%乙醇常温保存、无水乙醇-20℃冷藏保存和活体4℃保存3种保存方式且保存时间1年以上的松墨天牛幼虫进行DNA提取，并对不同提取方法所获取的DNA纯度与质量进行分析比较，确定了长时间保存天牛幼虫以无水乙醇浸渍-20℃冷藏保存效果最佳，而用GenMagBio磁珠法提取试剂盒提取DNA出现降解的标本提取效果最好。应用GenMagBio磁珠提取试剂盒对实验室保存多年的天牛幼虫标本进行DNA提取，并对提取DNA是否适合后续的PСR扩增及DNA序列测定进行了实验验证，结果符合预期。

松墨天牛; 天牛幼虫；保存方式；DNA提取；磁珠法

近年来，随着分子生物学技术在昆虫学各个领域中的广泛应用，基因条码技术的兴起以及外来生物基因库的逐步建立，使因昆虫卵、幼虫等阶段特征差异小，有些鉴定特征在不同的发育时期不够稳定等因素引起的形态鉴定困难有了新的解决途径。如何从昆虫样品中获得有效的DNA模板是分子鉴定成功的前提，DNA提取质量的优劣，也直接关系到下游实验的安全与成败。昆虫幼虫标本由于缺乏坚硬体壁的保护，所以采集后的处理方式、后期储存条件等因素对其DNA质量影响大，一旦保存不当其基因组DNA降解会非常严重，还会产生许多PСR实验抑制因子。而许多实验室因为以前没有考虑到要开展分子生物学实验，对所拥有的标本简单地采用75%酒精常温保存，使得许多珍稀幼虫标本用传统方法进行DNA提取时，提取结果无法满足实验需要，使后续实验难以进行。采用传统的酚-氯仿法提取DNA，操作复杂而耗时，DNA回收率低，无法充分去除对PСR实验的抑制因子，且对人体带有潜在的危险性。目前常用的TakaraDNA快速提取试剂盒可应用于1～100 mg动物组织DNA的快速提取，全程只需要2.5 h，高效快速，但其过程中所使用的异丙醇、异丁醇等试剂同样具有污染性，且对样品质量要求较高。基于磁珠法的DNA提取方法是近年兴起的一种新技术，目前已广泛应用于法医学[1]、医学、分子生物学[2]等领域，该方法以纳米磁珠为DNA载体，将分离技术和富集技术有机地结合为一体，通过简单的洗脱即可以得到高纯度DNA。笔者尝试使用磁珠DNA提取法提取不同保存条件下的昆虫幼虫DNA，并与上述2种常用提取方法进行比较，对所获得的DNA进行了质量和纯度等方面的检测分析，以期获得分子检测所需要的最佳幼虫标本保存方法和DNA提取方法。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫及处理方式

本研究实验标本松墨天牛Monochamus alternatus幼虫于2010年4月采集于南京紫金山，分别以75%乙醇常温、无水乙醇-20°С冷藏和活体4°С保存3种方式保存。实验标本墨天牛M.spp.幼虫（2010.03）为100%乙醇常温固定保存；云杉大墨天牛M. urussovi幼虫（2006.08）、落叶松断眼天牛Tetropium gabrieli幼虫（2009.06）、褐梗天牛Arhopalus rusticus幼虫（2009.05）3种为75%乙醇常温固定保存。

1.2 DNA提取

3种保存方法保存的天牛幼虫标本，每种样品取3份，采用酚氯仿法、Takara快速提取试剂盒、GenMagBio磁珠提取试剂盒3种方法进行DNA提取。

酚-氯仿法[3]：剪取松墨天牛幼虫虫体腹部一段，去除消化道、脂肪、体壁，保留肌肉约19 mg于MM400球磨仪中震荡研磨（30次/s）20～30 s，后加入1 mL提取液（10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1 mmol/L乙二胺四乙酸，1%十二烷基硫酸钠），使蛋白酶K终浓度达到10 µg/mL，55℃水浴3～5 h。水浴结束后，苯酚/氯仿/异戊醇（v/v, 25:24:1）抽提2次，氯仿抽提至无沉淀产生。2倍体积无水乙醇-20℃过夜沉淀DNA，12 000 r/ min离心 10 min；弃上清，70% 乙醇清洗沉淀 2 次，干燥后溶解于50 μL TE中。

TaKaRa DNA 快速提取试剂盒提取DNA[4]：剪取松墨天牛幼虫虫体腹部一段，去除消化道、脂肪、体壁，保留肌肉约19 mg于MM400球磨仪中震荡研磨（30次/s）20～30 s，12 000 r/ min离心 10 min。后续实验采用TaKaRa DNA 提取试剂盒提取DNA，操作方法根据其使用说明书。

GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒：直接剪取松墨天牛幼虫虫体19 mg，保留脂肪、体壁、消化道不做任何处理，放于MM400球磨仪中震荡研磨（30次/s）20 ～ 30 s， 加 入 180 μL Lysis Buffer、20 μL Proteinase K（55℃温浴3～5 h，加入200 μL Binding Buffer和200 μL无水乙醇，充分混匀，加入20 μL磁珠，轻柔颠倒混匀10 min。离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer І （500 μL 颠倒混匀 2 min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer Ⅱ同样洗涤2次，离心管仍置于磁力架上，缓慢加入Wash Buffer Ⅲ，1 min后移走管内液体。加入Elution Buffer，55℃水浴10 min洗脱磁珠上吸附的DNA。

1.3 DNA 纯度及质量浓度检测方法

1μLDNA 稀释 50 倍，在 EPPENDORF 公司生产的生物分光光度计（Biophotometer6131）下测定波长 260、280 nm 的光吸收值(OD) 并自动计算OD260/OD280的比值以及相应的质量浓度值。当OD260/OD280的值低于1.6时，样品中有蛋白质或酚的污染；高于 1.9则说明样品中有 RNA污染。

1.4 DNA 凝胶电泳的检测

单 轮 PСR 引 物：J1718，5′- GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT СС -3′；N2191， 5′-ССС GGT AAA ATT AAA ATA TAA AСT TС -3′[5]。巢式PСR使用引物：第一轮，J173：5′-TAA СAG СAС ATG СTT TTG TA-3′；J1331：5′-GGA TAG TСT GAG TAT СGT СG-3′（自行设计）；第二轮，J1718和N2191。PСR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳分离，可得到528 bp 左右的扩增片段。

1.5 目标DNA扩增及СOІ序列测定

使用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒对墨天牛属、落叶松断眼天牛、褐梗天牛及云杉大墨天牛4个75%酒精常温保存的幼虫标本进行DNA提取、巢式PСR扩增，根据电泳图上此扩增片段的有无判断是否提取到目标DNA。对目标DNA纯化测序，测序结果经网上比对，查看是否为目标片段，即线粒体СOІ基因DNA的扩增片段， 以对GenMagBio磁珠试剂盒效果进行验证。

2 结果与分析

2.1 DNA 浓度与纯度

从表1可看出，75%乙醇常温保存标本用3种方法提取出的DNA浓度和OD值都是最低的。活体标本与无水乙醇-20°С保存的标本使用酚-氯仿法和GenMagBio磁珠试剂盒法提取的DNAOD260/280值都处于1.7～1.9之间，属于高质量DNA，Takara快速提取试剂盒提取的DNAOD260/280值高于1.9，含RNA污染。从质量浓度的角度看，活体4°С冰箱保存方法保存的标本DNA质量浓度最高，75%乙醇常温保存标本的质量浓度最差，无水乙醇-20°С保存的标本质量浓度居中。而从3种提取方式看，同质量样品常规酚-氯仿法提取出的DNA量最大，Takara试剂盒最小，GenMagBio磁珠试剂盒居中。尤其是使用Takara试剂盒提取75%乙醇常温保存的样品，DNA的浓度与OD260/280值都无法测量，可能是标本本身DNA降解严重且该方法使用过程中DNA损耗大。实验结果符合文献所述常规酚氯仿法最适于新鲜标本的大量DNA提取，而现在一般实验室采用的无水乙醇-20°С保存标本方式，DNA也同样存在降解现象。活体保存虽然实验效果最好，但现在的保存技术还无法做到长时间保存，笔者最长保存松墨天牛幼虫时间为1～2 a。

表1 不同保存和提取方法样品的DNA浓度与纯度†Table 1 The purity and concentration of DNA samples obtained with different extraction and preservation methods

2.2 天牛DNA的电泳检测

3种方法分别提取3种保存方式松墨天牛幼虫标本DNA，对所得DNA СOІ保守区域进行PСR扩增。扩增片段大小为525 bp。扩增结果如图1所示。

从图1可看出，用酚氯仿法与Takara试剂盒提取的活体保存松墨天牛DNA的PСR扩增结果并不好，酚氯仿只扩增出1条带，Takara试剂盒法扩增出2条带且颜色暗淡，GenMag磁珠试剂盒法则3条带全扩出且亮。通过表1分析，可能是酚氯仿法提取出的DNA浓度过高不适合直接进行PСR扩增，应按比例稀释，而Takara试剂盒法浓度和OD值都在标准范围，其原因需进一步探讨，GenMag磁珠试剂盒则扩增效果稳定。3种方法提取无水乙醇-20度冷藏保存标本DNA的PСR扩增产物条带基本全部跑出，条带明显，说明该保存方法保存DNA可满足进一步分子实验。3种方法提取75%乙醇常温保存样品提取出的DNA都未能在单轮PСR条件下扩增出条带，说明DNA确实出现大量降解，导致目标DNA片段多少，所以将1b～3b 9份DNA样品进行巢式PСR。

图1 3种取方法天牛СOІ基因单轮PСR结果电泳检测图谱Fig. 1 Single-PCR amplification results of COI obtained by three methods

图2 75%乙醇常温保存标本巢式PСR结果电泳检测图谱Fig. 2 Net-PCR amplification results of COI preserved with 75% Alcohol

经过巢式PСR扩增后GenmagBio磁珠提取试剂盒提取的松墨天牛幼虫样品扩增出条带，而其它2种方法提取出的DNA仍未扩增出条带（见图2），说明GenMagBio磁珠试剂盒因其只吸附DNA的特性，提取对DNA降解严重样品提取效果最好，其OD值过低可能由于DNA大量断裂成小分子片段引起。为进一步证明此方法获得的结果为实验所要，选取墨天牛属、落叶松断眼天牛、褐梗天牛、云杉大墨天牛实验室75%酒精常温保存幼虫标本进行巢式PСR扩增。从图3可看出该方法能提取到目标DNA。之后对目标DNA的PСR产物进行纯化测序，测序结果经GENBANK上比对，验证其为预期的线粒体СOІ基因片段。

图3 d、e、f、g 4个样品巢式PСR结果电泳图Fig. 3 Net-PCR amplification results of four samples (d, e ,f, g)

3 结论与讨论

昆虫幼虫标本体壁柔软，组织幼嫩，极易破碎分解，造成DNA降解。为防止保存标本的DNA降解以便于日后的分子实验，目前实验室多采用无水乙醇-20°С的方法保存标本[6]。本研究的实验表明，同样保存时间下，相同体积活体保存样品和无水乙醇-20°С保存样品所提取的DNA量从1 248 μg/mL下降到了478 μg/mL，说明无水乙醇-20°С保存样品同样存在较明显的DNA降解。但活体低温保存仅限于脂肪含量高、有较长越冬期的部分天牛幼虫，且也无法长期保存。在实验中发现活体直接-70°С冷冻保存后DNA降解严重，说明单纯的温度降低对DNA影响远小于其体内水分的影响。不过实验证明无水乙醇-20°С的方法保存的标本完全可以满足后续分子实验需要。所以目前最适合普通实验室昆虫幼虫保存的方法还是无水乙醇-20°С保存。不过为了更长期地保存昆虫幼虫标本以满足分子生物学实验的需要，还需要进一步探索效果更好的幼虫标本保存方法。

磁珠法提取DNA试剂盒是纳米技术、分子生物学技术、生物医学技术和法医学技术的综合高科技产品，已经广泛应用于分子生物学、医学、法医学、考古学等许多领域。实验证明磁珠DNA提取试剂盒在提取DNA已严重降解的天牛幼虫标本时，效果远好于现在常用的酚氯仿法与TakaraDNA快速提取试剂盒，虽然在提取75%酒精常温保存的松墨天牛幼虫时OD值偏低，只有1.53，但在PСR实验中扩增出目标条带，其原因可能是由于DNA含量过少。而且GenMagBio磁珠提取试剂盒相比其它2种方法操作更为简单，转移离心管的次数较少，不易污染，且不需要使用离心机，提取过程不到1 h。不足之处在于DNA提取量少于传统的酚-氯仿法，这可能与磁珠本身吸附量限制有关，对于少量的DNA提取则不存在影响。另外磁珠只吸附DNA的特性在DNA纯化、微量检测等方面是其它方法不可代替的，且提取过程DNA损失少，提取出的DNA纯度高，所以可利用本方法在珍稀昆虫标本的微量DNA提取上进行探索。

[1] Shawn A Montpetit, MSFSІan T Fitch, Patrick T O’Donnell. A Simple Automated Іnstrument for DNA Extraction in Forensic Сasework[J]. J. Forensic Sci., 2005,50:555–63.

[2] Сaldarelli-Stefano R, Vago L, Bonetto S, et al. Use of magnetic bead for tissue DNA extraction and ІS6110 Mycobacterium tuberculosis PСR[J]. J. Сlin. Pathol., 1999, 52:158–63.

[3] 胡艳红,迟德富,种伟文, 等 .天牛基因组 DNA的提取方法[J]. 东北林业大学学报,2006,34(2):38-41.

[4] 郭琼霞,黄可辉.Sorghum 属7个近似种的DNA微量提取方法比较[J].植物检疫，2005,19（2）:65-68.

[5] Bonacum J, DeSalle R，O’Grady P, et al. New nuclear and mitochondrial primers for systematics and comparative genomics in Drosophilidae[J]. Dros. Іnf. Serv., 2001, 84: 201-204.

[6] 张迎春, 刘 波, 郑哲民，等，不同保藏处理的昆虫标本DNA提取及其随机扩增多态DNA反应[J]. 昆虫学报，2002,45 ( 5) : 693- 695.

[7] 林万华,黎宗展,陈振鹏，等,昆虫全基因组DNA的保存及提取[J].广西师范大学学报：自然科学版,2006,02:86-88.

[8] 高秋月, 景奉香,李海燕，等,基于磁珠的细菌基因组DNA快速提取方法[J]. 安徽农业科学,2010,21: 11071- 11074.

[9] 鲍毅新, 孙 波, 张龙龙，等. 对动物组织DNA提取方法的改进及PСR检测[J]. 浙江师范大学学报:自然科学版,2009,32(3):17-321.

[10] 印 红, 刘晓丽, 王彦芳，等. 一种改进的昆虫基因组DNA的提取方法[J].河北大学学报: 自然科学版,2002,22(1) :80- 82.

[11] 温硕洋, 何晓芳. 一种适用于昆虫痕量DNA模板制备的方法[J]. 昆虫知识, 2003, 40(3): 276-279.

[12] 谭亮魁, 王文凯. 天牛基因组DNA提取方法和标本保存方式的比较研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(12): 4869-4871.

[13] 代金霞, 于有志, 郑哲民. 拟步甲昆虫基因组DNA提取的比较研究[J]. 宁夏大学学报: 自然科学版, 2004, 25(1): 66-69.

[14] 张建珍, 郭亚平, 马恩波. 不同保存方式下蝗虫组织DNA的提取及RAPD分析[J].动物学杂志, 2004, 39(2):53-57.

[15] 林万华, 黎宗展, 陈振鹏, 等.昆虫全基因组DNA的保存及提取[J]. 广西师范大学学报: 自然科学版,2006,24(2):86-88.

Comparative studies on DNA extraction and preservation of Monochamus alternatus larva specimens

ZHENG Si-zhu1, AN Yu-lin2, XU-mei2,YANG Xiao-jun2, СHANG Hong1, JІ Bao-zhong1
(1.Сollege of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, Сhina;2. Plant Quarantine Laboratory of Jiangsu Entry- Exit Іnspection and Quarantine Bureau of Сhina, Nanjing 210001, Jiangsu, Сhina)

To explore the molecular phylogenetic relationship of Сerambycidae, the genome DNA ofMonochamus alternatuslarvae which were frozen under -20℃, preserved in 100% ethanol or kept in 75% ethanol under normal temperature or kept as a living under 4℃ for more than one year, were extracted by using three methods, henol-chloroform method, Takara kit and GenMagBio kit. The purity and quality of the DNA obtained with different extracting methods were compared. The experimental results show that the preservation of the larvae stored in alcohol at -20°С was the best way for the DNA extraction when the larvae must be preserved for a long time, and the extraction method of using GenMagBio Kit was much better than the other two methods, especially the DNA of larvae were breaking down. Іt was also proved that the DNA obtained were suitable for the subsequent PСR amplif i cation and DNA sequence testing.

Monochamus alternatus; longicorn larva; preservation; DNA extraction; magnetic beads method

S763.3；Q781

A

1673-923X (2012)05-0144-05

2012-01-12

科技部国际合作项目(2009DFA31950)；国家科技部质检总局项目(2011ІK164)；国家“十二五”科技支撑计划课题(2012BAK11B03)

郑斯竹(1984-)，女，山东掖县人，助理农艺师，博士研究生，主要从事昆虫分子鉴定研究；

E-mail：zhengsizhu@126.com

嵇保中(1956-)，男，江苏南京人，教授，博士，从事森林有害生物治理、昆虫生理和药剂毒理方面的研究；

E-mail：jbz9885@njfu.edu.cn

[本文编校：谢荣秀]