运动对大鼠骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平及核内PGC-1、HDAC5蛋白含量的影响

张红学，郭海峰，马延超

运动对大鼠骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平及核内PGC-1、HDAC5蛋白含量的影响

张红学1，郭海峰2，马延超3

目的：研究运动后不同时间大鼠骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平及核内PGC-1、HDAC5蛋白含量的变化，以探讨运动后PGC-1α基因表达时相性变化的调节机制。方法：9周龄的雄性Wistar大鼠（167±4）g 48只，随机分成安静对照组（C）和跑台运动后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h取材组，共6组，每组8只。大鼠进行0坡度的1 h跑台运动，跑台速度34 m/min。Western blot法测定蛋白含量及磷酸化水平，RT-PCR法测定基因表达。结果：PGC-1αmRNA含量，运动后即刻变化不显著，运动后3 h、6 h显著增加，12 h虽仍高于对照组，但与6 h相比显著降低，24 h恢复至安静水平。核内PGC-1α蛋白含量运动后各取材点均无显著变化。核内HDAC5蛋白含量则在运动后3 h、6 h下降显著，12 h虽仍低于对照组，但与6 h相比显著增加，24 h恢复到安静组水平。CaMKⅡ磷酸化水平，运动后0 h，3 h显著升高，6 h虽仍高于对照组，但与3 h相比显著降低，12 h恢复至安静水平。结论：运动后PGC-1α基因表达的时相性变化可能是由对应时相变化规律的CaMKⅡ通过调节核内HDAC5含量，解除了转录因子对PGC-1α基因转录的抑制而实现。

过氧化物酶体增生物受体γ共激活因子-1α；钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ；组蛋白脱乙酰基酶5

过氧化物酶体增生物受体γ共激活因子-1α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ Coactivator-1α，PGC-1α） 是线粒体生物合成、细胞呼吸和能量底物利用的重要调节因子[1]。运动能够提高骨骼肌PGC-1α基因的表达[2-3]，更有多项研究提示运动后PGC-1α基因表达呈时相性变化[4-6]，这对于改善糖尿病人胰岛素抵抗，降低血糖浓度等有着重要的意义[7-8]，但机制尚不明确。

以往研究显示，PGC-1α基因的转录激活依赖于其启动子区域保守转录因子结合位点[9-10]与转录因子的功能性交互作用[11-13]。目前离体研究结果显示，核内组蛋白去乙酰化酶5（Histone deacetylase 5，HDAC5）蛋白能够抑制转录因子对靶基因的转录的调节[14-15]，核内PGC-1α蛋白则可以通过招募具有组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyhransferases，HATs）活性的共同激活因子而开启转录因子对靶基因转录的调节[16－17]，而运动对核内HDAC5及PGC－1α蛋白含量的影响，目前尚不清楚。另有研究发现[18]，咖啡因孵育激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶（Calcium/calmodulin－dependent protein kinase，CaMK） 后，PGC－1α mRNA表达显著升高，且CaMK抑制剂KN93抑制了这种增加，提示CaMK同样参与调控了PGC－1α mRNA的表达。

本研究的目的是试图在以往研究基础上，更加深入的了解运动后大鼠骨骼肌PGC－1α基因表达时相性变化规律，并在此基础上研究了运动后不同时间核内PGC－1、HDAC5含量及CaMKⅡ磷酸化水平的变化，以进一步了解运动后PGC－1α基因表达时相性变化的调节机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组

以8周龄Wistar大鼠为研究对象，健康清洁级，体重（167±4）g。试验期间，饲养环境温度24℃，相对湿度40%～60%，光照12 h/天，并按照国家啮齿类动物饲养标准饲养。经过1周喂养后，48只大鼠随机分成安静对照组（C）和跑台运动后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h 取材组，共 6 组，每组 8 只。

1.2 运动方案

安静对照组大鼠无任何运动负荷。运动组大鼠运动方式为0坡度跑台运动，跑台速度为 34 m/min（约 85%VO2max）[19]，运动时间为1 h。运动组大鼠取材时间点为：运动后即刻，运动后3 h，运动后6 h，运动后12 h和运动后24 h。腹腔注射乌拉坦（5 ml/KG）麻醉，断头方式处死，取双侧股四头肌，迅速投入液氮，后转移至－80℃保存。

1.3 指标测定方法

1.3.1 PGC-1α mRNA 大鼠骨骼肌总mRNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol试剂盒。PGC－1α mRNA表达采用实时荧光定量（Real－Time PCR）法。杭州柏恒科技有限公司生产的PCR扩增仪进行mRNA逆转录（RT），型号GT9631，RT－PCR试剂盒购自Promega公司。逆转录合成的cDNA储存在－20℃冰箱备用。美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪进行PCR扩增，型号是7300，PCR扩增试剂盒同样购自美国应用生物系统公司。引物委托大连宝生物有限公司合成。上下游引物序列为：PGC－1α a，5'ACG GGA TGT GGT AGA TCG TG3'；PGC－1α s，5'GGC GAC GTT AGT AAG TGG CT3'。 PGC－1α mRNA表达结果以比较CT法相对定量。

1.3.2 p-CaMKⅡ、HDAC5、PGC-1α蛋白表达 在液氮中将60 mg股四头肌组织研磨成粉末，600 μL裂解液（50mM Tris－CL PH7．8，150 mM NaCL，5 mM EDTA，1%Triton－x－100，蛋白酶抑制混合物（购自sigma））充分裂解后，12 000 rpm/min低温离心1 h，上清液即为骨骼肌总蛋白。核内蛋白的提取采用皮尔斯（Pierce）公司的核蛋白试剂盒。蛋白相对表达量采用Western blot法。相关指标的关键条件：PGC－1α、p－CaMKⅡ、均采用聚丙烯酰胺凝胶浓度10%，HDAC5采用浓度为8%的胶。一抗比例分别 为 ：PGC －1α （Abcam）1∶1 000 ；HDAC5 （Cell Signaling Technology）：1∶1000；p－CaMKⅡ （Santa Cruz）1∶1500；β－actin（Santa Cruz）1∶1 000；H 1（Santa Cruz）：1∶800。二抗购自 Cell Signaling Technology，比例分别为 HDAC5 1∶4000；H1 1∶6000；PGC－1α 1∶5000；β－actin 1∶4000；p－CaMKⅡ1∶3000。目的蛋白相对表达量用目的蛋白与内参蛋白的积分灰度值的比值表示。

1.4 统计学处理

实验数据的处理采用SPSS 13．0分析软件，结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示。同一指标在不同组别之间的差异性采用单因素方差分析。显著性水平为P＜0．05，非常显著性水平为P＜0．01。

2 实验结果

2.1 PGC-1α mRNA相对表达量

由图1可见：运动后即刻PGC－1α mRNA表达含量与对照组相比变化甚微，不具有显著性差异（P＞0．05）。与对照组相比，大鼠骨骼肌PGC－1α mRNA表达在运动结束后3 h、6 h分别增加了 4．6 倍和 5．9 倍，具有非常显著性差异（P＜0．01），且运动后6h显著高于运动后3 h（P＜0．05）。运动后12h大鼠骨骼肌PGC－1α mRNA 表达含量虽然显著低于运动后 6 h（P＜0．01），但与对照组相比，仍具有非常显著性差异（P＜0．01）。运动后24h大鼠骨骼肌 PGC－1α mRNA 表达含量显著低于运动后 12 h（P＜0．01），且与对照组相比，没有显著差异（P＞0．05）。

2.2 核内PGC-1α蛋白相对表达量

由图2可以得知，运动后各组大鼠骨骼肌核内PGC－1α蛋白均无显著变化。

2.3 核内HDAC5相对表达量

由图3可以得知，大鼠骨骼肌核内HDAC5蛋白含量在运动后即刻，与对照组相比变化甚微，不具有显著性差异（P＞0．05），运动后3 h、6 h组大鼠骨骼肌核内HDAC5蛋白含量与对照组相比，显著下降（P＜0．01），且运动后 3 h组与运动后即刻组相比具有显著性差异（P＜0．05）；运动后12 h组与运动后6 h组相比，核内HDAC5蛋白表达含量显著增加（P＜0．05），但是与安静对照组相比，大鼠骨骼肌核内HDAC5蛋白含量仍显著下降（P＜0．05），运动后24 h组与运动后12 h组相比，同样显著增加（P＜0．05），且已增加至安静水平。

图2 各组大鼠骨骼肌PGC-1α蛋白表达Fig.2 PGC-1α Protein expression in Various Groups

图3 各组大鼠骨骼肌HDAC5蛋白表达Fig.3 HDAC5 Protein expression in Various Groups

由图4可以得知，骨骼肌内CaMKⅡ磷酸化水平在运动后即刻、3 h、与安静对照组相比，均具有非常显著性差异（P＜0．01），且运动后3 h组与运动后即刻组相比，具有非常显著性差异（P＜0．01）。运动后6 h组与运动后3 h组相比，CaMKⅡ磷酸化水平显著下降（P＜0．05），但与安静对照组相比仍具有非常显著差异（P＜0．01）。运动后12 h骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平显著低于运动后 6 h（P＜0．01），且其恢复至安静水平。

3 分析讨论

3.1 运动对大鼠骨骼肌PGC-1α mRNA表达的影响

PGC－1是最先在小鼠的棕色脂肪组织中发现，由于它可以促进过氧化物酶体增生物受体 γ（Peroxisome Proliferator－Activated Receptor γ，PPAR）的转录，而命名为过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1[20]。有研究显示，PGC－1α可以通过激活肌细胞增强因子 2（myocyte enhancer factor 2，MEF2），促进葡萄糖转运子4（glucose transporter，GLUT4）基因转录和蛋白表达，改善骨骼肌糖代谢[7－8]。由此可见，骨骼肌中PGC－1α表达的下降，必然会引起GLUT4表达的下降，葡萄糖转运功能的障碍及血糖的升高。因此提高骨骼肌PGC－1α的表达，对于改善胰岛素抵抗，提高骨骼肌葡萄糖摄取速率以及降低血糖含量方面有着重要意义。

图4 各组大鼠骨骼肌核内CaMKⅡ磷酸化水平Fig.4 Phosphorylatiion Activity of CaMKⅡin Various Groups

动物实验和人体试验均已经表明，不同强度、不同时间的急性运动均能引起PGC－1α mRNA表达的增加[21]，但是运动引起的PGC－1α mRNA表达持续时间各研究结果并不相同[4－6]。NORRBOM J等让9名受试者进行最大单腿直膝负荷运动至力竭后，发现运动后2 h PGC－1α mRNA增加显著，且在运动后6 h发现仍显著高于运动前水平[4]。PILEGAARD H等也发现受试者进行双腿伸膝运动后，骨骼肌PGC－1α mRNA表达在运动后2 h显著增多，运动后6 h仍显著高于运动前，运动后24 h PGC－1α mRNA表达水平降至运动前水平[5]。BRENFAN EGAN等[6]发现，8名受试者40%VO2max和80%VO2max强度功率自行车运动后3 h PGC－1α mRNA 表达分别增加了大约 3．8 倍和 10．2 倍，运动后19 h骨骼肌内PGC－1α mRNA表达回落至安静水平。

由以上研究结果可以看出，现有研究对于运动后不同时间PGC－1α基因表达量的研究，由于运动后取材时间点较少，很难把握运动后PGC－1α基因表达的时相性变化规律。本研究选择大鼠运动后 0 h、3 h、6 h、12 h、24 h共 5个取材时间点取材测定PGC－1α mRNA含量，以试图更加深入的了解运动后24 h内PGC－1α基因表达的时相性变化规律，并在此基础上进一步探讨运动过后PGC－1α基因表达时相性变化的调节机制。本实验研究结果显示，PGC－1α基因表达在运动后0 h变化不显著，3 h已经显著升高，6 h继续增加，6 h－12 h达到最高水平并开始下降，但12 h仍显著高于安静水平，24 h下降至安静水平。

3.2 运动对大鼠骨骼肌细胞核内PGC-1α表达的影响

研究显示，PGC－1α基因的启动子上含有保守转录因子结合位点，如MEF2结合位点和环腺苷酸反应元件（c－AMP response element，CRE）序列[9－10]，生理刺激条件下相应的结合蛋白，即转录因子，如MEF2、骨骼肌细胞内活化转录因子2（activating transcription factor－2，ATF－2）和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB） 等[13，22]，通过和PGC-1α基因的启动子保守转录因子结合位点结合，而参与调节PGC-1α基因的转录[11-12]。转录因子结合位点的变异会抑制运动神经对PGC-1α刺激的响应[23]，提示了PGC-1α的转录激活依赖于转录因子与PGC-1α启动子的功能性交互作用[11-13]。

基础状态下转录因子对靶基因的转录的调节处于抑制状态，其重要原因是由于真核细胞核小体组蛋白处于去乙酰化状态，并与核小体主链DNA紧密结合，阻碍了转录因子与主链靶基因的结合作用[14-15]。生理刺激状态下，核小体组蛋白需要恢复到乙酰化状态，暴露靶基因的转录因子结合位点，才能开启转录因子对靶基因的转录[24-25]。研究显示，核小体的这种乙酰化和去乙酰化状态的转化，受PGC-1α自我调节机制的调节[9，26]。PGC-1α通过招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子，使核小体由去乙酰化状态转变为乙酰化状态而开启转录因子对自身表达的调节[16-17]。由于基因转录主要在细胞核内进行，提示PGC-1α核内表达的增多必然引起转录因子对靶基因转录的增加。

事实上，目前关于运动对PGC-1α蛋白的影响的研究比较多[27-28]。值得注意的是，虽然这些研究提示了运动可以引起PGC-1α蛋白表达的提高，并且也有研究涉及到了PGC-1α蛋白表达的时相性变化，如SHIN TERADA等的研究显示大鼠进行每次3 h，中间休息45 min总共6 h的低强度跑台运动后发现，在运动后即刻，运动后6 h和运动后18 h股四头肌PGC-1α蛋白表达量分别增加了75%、95%和60%[29]。但这些研究多集中于骨骼肌细胞总PGC-1α含量的研究，运动后是否对骨骼肌细胞核内蛋白表达产生影响，以及这种影响是否同样呈时相性，目前尚不清楚。

本实验假设运动通过提高大鼠骨骼肌核内PGC-1α蛋白，并通过自我调节机制提高转录因子对PGC-1α基因的转录。而本实验结果显示，运动后24 h之内各取材时间点大鼠骨骼肌核内PGC-1α蛋白与对照组相比均无显著变化，可能提示了运动对骨骼肌细胞核内蛋白表达作用并不明显。虽然离体研究显示核内PGC-1α蛋白的增多，能够促进转录因子对PGC-1α基因的转录，但其可能并不是影响运动后PGC-1α基因表达时相性变化的主要因素，机体还存在着其他机制调节了转录因子对PGC-1α基因转录的调节作用。

3.3 运动对大鼠骨骼肌核内HDAC5含量及CaMKⅡ磷酸化水平的影响

如前所述，基础状态下由于真核细胞核小体组蛋白处于去乙酰化状态，而抑制了转录因子对靶基因PGC-1α的转录的调节。近年来有研究发现，基础状态下真核细胞核小体组蛋白的去乙酰化状态主要有细胞核内HDAC5蛋白维持[14-15]，HDAC5通过对核小体组蛋白赖氨酸侧链的去乙酰化，使核小体组蛋白赖氨酸残基侧链带上正电荷，并与原本带负电荷的核小体DNA主链紧密结合而形成致密的核小体结构，阻碍转录因子与靶基因启动子区域DNA结合位点结合，从而抑制了靶基因PGC-1α的转录[25]。生理刺激状态下，HDAC5通过与14-3-3蛋白伴侣结合后转移出核，解除对转录因子对靶基因PGC-1α转录活性抑制[30-31]。

运动能够PGC-1α基因转录，那么运动对细胞核内HDAC5含量产生什么样的影响呢，目前尚不清楚。本实验结果显示，核内HDAC5在运动后即可没有显著变化，在3h显著降低，且6 h继续降低，在6~12 h内降低至最低水平随后开始升高，但12 h仍低于对照组，24 h恢复至安静水平。这一结果提示我们，首先运动可以显著降低核内HDAC5。其次核内HDAC5显著降低的时间段也是在运动后3~12 h这个时间范围，这和运动后PGC-1α mRNA增加时间段相吻合，提示了PGC-1α基因表达时相性变化可能是由具有同样时相性变化规律HDAC5的出核作用，通过解除了转录因子对PGC-1α基因转录的抑制而实现。

以往离体研究结果HDAC5的出核速率与其磷酸化水平高度正相关，特别是HDAC5 S295和S498两个位点的磷酸化，能够引起HDAC5与其14-3-3蛋白伴侣结合并转移出核，解除其对转录因子的抑制，使转录因子发挥其对靶基因PGC-1α基因的转录作用[30-31]。CaMK作为一类分布广泛的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，研究发现CaMKⅠ和Ⅳ亚型均可磷酸化HDAC5的S295和S498位点[15，32]。但它们在骨骼肌细胞中并不表达[33-34]。研究者把重点转移到了主要存在于骨骼肌中的CaMKⅡ亚型[35-36]，发现虽然CaMKⅡ并不能直接磷酸化HDAC5，但可直接磷酸化HDAC4，并由HDAC4将磷酸化信号传递给HDAC5，即HDAC5被CaMKⅡ间接磷酸化，接着磷酸化了的HDAC4-HDAC5二聚物结合与伴侣蛋白14-3-3三者一同转移出核，从而解除HDAC5对细胞核内转录因子的抑制作用，提示CaMKⅡ对于HDAC5的出核有重要调节作用。

本实验测定了运动后CaMKⅡ磷酸化水平，以试图验证这一假说。本实验结果显示，骨骼肌内CaMKⅡ磷酸化水平在运动后3 h、6 h与安静对照组相比，均具有非常显著性差异，提示了CaMK参与调节了运动后3~6 h HDAC5的降低和PGC1表达的提高，与我们实验假设相一致。而本实验中运动后12 h骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平恢复至安静水平的同时，HDAC5含量与6 h相比开始升高，而PGC1表达量与6 h相比开始下降，可能为此推测提供了进一步证据。

4 结 论

运动后PGC-1α基因表达的时相性变化可能是由对应时相变化规律的CaMKⅡ通过调节核内HDAC5含量，解除了转录因子对PGC-1α基因转录的抑制而实现。

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Effects of Exercise on CaMKⅡPhosphorylation and Nuclear PGC-1α/HDAC5 Protein Expression in Rats Skeletal Muscle

ZHANG Hongxue1，GUO Hangfeng2，MA Yanchao3
（1.School of PE，Zhengzhou University，Zhengzhou 450044，China；2.School of PE，Henan Scientific and Technical University，Luoyang 471003，China；3.School of PE，Luoyang Normal University，Luoyang 471022，China）

Objective：The phosphorylation activity of CaMKⅡ，nuclear PGC-1α and HDAC5 protein content was measured to explore the mechanism of the phasic change of PGC-1α gene expression after treadmill running.Methods：48 nine week-old male Wister rats （167±4g）were randomly assigned to the Control group and five different groups that were measured at 0h，3h，6h，12h and 24h after exercise.Rats undertook treadmill running for 1 hour at 0°slope.Results：Compared to the Control group，the expression of PGC-1α mRNA was greatly increased 3h and 6h after exercise.Though the abundance of PGC-1α mRNA decreased 12h after exercise，it's still higher than that in control group and it returns to normal at 24h after exercise.The expression of nuclear PGC-1α protein was unchanged after exercise.The expression of nuclear HDAC5 significantly decreased 3h and 6h after exercise，the 12h group increased greatly compared to the 6h group，though it's still lower than the control group and it returns to normal at 24h after exercise.Compared to the control group，the phosphorylation activity of CaMKⅡ was greatly increased 0h and 3h after exercise.Though the phosphorylation activity of CaMKⅡ decreased 6h after exercise，it's still higher than the control group and it returns to normal at 12h after exercise.Conclusion：Phasic change of the expression of PGC-1αmRNA in rat skeletal muscle was observed in this study，and this is possibly induced by CaMKⅡ which lead the HDAC5 out of the nucleus.

PGC-1α；CaMKⅡ；HDAC5

G 804.7

A

1005-0000（2012）03-270-05

2012-01-03；

2012-04-13；录用日期：2012-04-15

河南省科技厅科技发展项目（项目编号：122300410257）；河南省科技厅科技计划基金项目（项目编号：120400450006）

张红学（1970-），男，河南商丘人，副教授，研究方向为运动与糖代谢。

1.郑州大学体育学院，河南郑州450044；2.河南科技大学体育学院，河南洛阳453007；3.洛阳师范学院体育学院，河南洛阳471022。