柳枝稷人工穗芽高效再生体系的建立

柴乖强，徐开杰，王勇峰，孙风丽，宋立立，刘曙东，奚亚军＊

（1.西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌712100；2.沧州师范学院生命科学系，河北 沧州061001）

随着社会的发展，人类对能源的需求日益剧增。然而全球化石能源的不可再生性以及大量使用导致了大气污染、全球气候变暖等一系列环境问题［1，2］。因此，寻求一种新的可再生替代能源成为摆在人们面前的一项重要的工作。柳枝稷（Panicumvirgatum）原产于北美，属禾本科（Gramineae）黍属（Panicum），是一种多年生暖季型草本C4植物［3，4］，通常被用来放牧、水土保持以及生态建设。与传统作物相比，柳枝稷的抗旱能力强、耐瘠薄、病虫害少、生物学产量高，加上易播种出苗和建立植被以及纤维素和半纤维素能较高地转化为乙醇等优点，近年来被国际上广泛作为一种理想的生物能源植物并进行了深入研究［5－8］。保存和快速繁殖优质原始材料是支撑现代生物育种技术发展的重要内容之一。为了适应现代生物育种工作的需要，柳枝稷的离体培养和快速繁殖技术受到了越来越多的重视。孟敏等［9］、Jason等［10］均以柳枝稷幼穗和成熟种子为外植体，通过诱导胚性愈伤组织增殖出大量的柳枝稷幼苗。然而，由于柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面受基因型限制，且存在培养周期长，再生率低等缺点，使其在柳枝稷离体培养和快速繁殖上的应用受到了一定限制。

利用植物不同器官作为外植体诱导丛生芽进而建立高效再生体系，是组织培养最直接、最简便、成苗速度最快的途径之一［11］。迄今已有多种植物利用芽顶端分生组织［12－17］或茎节［18］为外植体诱导丛生芽，从而建立了其植株再生体系。而通过幼穗直接诱导人工穗芽目前还未见报道。本课题组在研究中发现，在人工诱导柳枝稷的幼穗形成过程中，通过人工处理可获得少量幼芽（人工穗芽），在适宜培养基上诱导和人工促进可使穗芽在短时间内大量扩增，通常形成包含数十条或一百余条不等的穗芽块，为避开传统通过胚性愈伤组织再生植株建立了一条简便易行的途径。本试验通过对柳枝稷人工穗芽的培养条件、处理方法等进行系统研究，以期建立较为高效的柳枝稷人工穗芽再生体系，为柳枝稷的离体繁殖乃至生物技术育种研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试材料为‘西稷1号’、‘西稷2号’和‘西稷3号’3个基因型，由西北农林科技大学农学院柳枝稷分子育种课题组选育提供。试验于2010年8月－2011年5月在西北农林科技大学小麦改良中心分子生物学实验室进行。

1.1.2 试验初始培养基 诱导与增殖培养基：MS（Murashige and Skoog）＋3.00mg／L 6－BA（6－Benzylamin－opurine）＋3.00%蔗糖＋0.75%琼脂，pH 值5.8；生根培养基：1／2MS＋1.00%蔗糖＋0.70%琼脂，pH 值5.8。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验采用单因素寻优的方法，以诱导与增殖培养基为初始基本培养基，各单因素试验依次以前一试验研究结果为基础，依次从柳枝稷的基因型、幼穗长度、激素、初次切割时期穗芽长度、大量培养阶段穗芽长度、碳源、pH值、穗芽块的切割方式和生根培养基等进行培养因素的优化选择，以建立柳枝稷人工穗芽高效再生体系。试验各因素包括水平如下：基因型三水平包括西稷1号、西稷2号、西稷3号；幼穗长度四水平包括0.5，1.0，1.5和2.0cm；激素处理五水平分别为2.00mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D，2.50mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D，3.00mg／L 6－BA，3.00mg／L 6－BA＋0.10mg／L 2，4－D，MS＋3.50mg／L 6－BA；初次切割时期穗芽长度四水平包括初次穗芽长度0.5，1.0，1.5和2.0cm；大量培养阶段穗芽长度四水平包括穗芽长1.0，1.5，2.0和2.5cm；碳源三水平包括30g／L蔗糖、30g／L麦芽糖、30g／L甘露醇；pH 值五水平分别为5.4，5.6，5.8，6.0，6.2；穗芽块的切割方式两水平包括横切和纵切；4种生根培养基分别为1／2MS、1／2MS＋0.5mg／L IBA、1／2MS＋0.5mg／L NAA 和1／2MS＋0.5mg／L IBA＋0.5mg／L NAA。

1.2.2 外植体的准备与诱导 在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，人工剥取1cm左右的穗下茎节。先用体积分数为70%的酒精表面消毒1min，倒掉酒精后加入适量体积分数为5%的NaClO（有效氯≥0.9%）溶液灭菌约1～2min，再用无菌水冲洗3～4次。

将灭好菌的幼穗用无菌手术刀从中间纵切成两半，根据各试验进程，依次分别接种到上述各培养基中，每个处理重复3次，每个重复接种3个幼穗。并置于28℃，光照16h／d，光照强度12 000lx的光照培养箱中进行培养，每次从诱导好的穗芽基部2mm处切去穗芽，人工切割5次后，于超净工作台内调查统计人工穗芽的数目。穗芽的诱导过程见图1。

图1 柳枝稷人工穗芽培养Fig.1 Artificial ear buds formation of switchgrass

1.2.3 测定项目与方法 调查人工穗芽的增殖效率、生根率和幼苗移栽成活率。计算公式为：

1.3 数据处理

数据采用SAS 8.1软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 基因型对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

西稷1号、西稷2号和西稷3号3个基因型的外植体接种后诱导出幼穗的时间存在差异（表1），其中西稷1号和西稷3号诱导出幼穗的时间相同，但西稷2号则较西稷1号和西稷3号延长了2d，表明西稷2号的幼穗诱导周期较长。

不同基因型对柳枝稷幼穗的增殖效率存在差异，其中，西稷1号基因型的幼穗增殖效率最高，西稷2号幼穗增殖效率最低，西稷3号的幼穗增殖效率介于两者之间。方差分析结果表明，西稷1号的增殖效率显著高于西稷3号（P＜0.05），而极显著高于西稷2号（P＜0.01），西稷2号和西稷3号之间的差异也达到极显著水平（P＜0.01）。说明西稷1号为较理想的基因型，其次为西稷3号，而西稷2号基因型的增殖效果最差。

表1 基因型对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 1 Effects of genotype on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表2 幼穗长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 2 Effects of young panicle length on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.2 幼穗长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

选用西稷1号基因型的柳枝稷诱导穗芽，结果表明（表2），不同长度西稷1号基因型的幼穗对柳枝稷人工穗芽的增殖效率有很大的影响。随着幼穗长度的增加，增殖效率呈先增后减的趋势，而取长度为1.5 cm的幼穗时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，为1 600.00%。方差分析表明，长度为1.5cm的幼穗增殖效率极显著高于其他长度的幼穗（P＜0.01）。因此，选用西稷1号基因型长度为1.5cm的幼穗进行穗芽增殖较为理想。

2.3 生长激素配比对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

6－BA是一种高效的植物细胞分裂素，它调控细胞核基因的活性和蛋白质的磷酸化与翻译［19］。6－BA对西稷1号基因型柳枝稷的长度为1.5cm幼穗的穗芽增殖有明显的促进作用，且其促进作用在6－BA浓度为3.0mg／L时达到最高，其后则呈减弱趋势（表3）。适量2，4－D的加入，也会明显增加柳枝稷的穗芽增殖效率。初始基本培养基中生长激素组合为3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，为2 333.33%。经方差分析，3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D激素组合与3.0mg／L 6－BA 和3.5mg／L 6－BA 的穗芽增殖效率差异不显著，而显著高于激素组合2.5 mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D（P＜0.05），极显著高于2.0mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D（P＜0.01）。由于激素组合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D的穗芽增殖效率略高于生长激素3.0mg／L 6－BA，因此在西稷1号基因型柳枝稷穗芽再生体系后期试验中采用激素组合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D。

2.4 初次切割时期穗芽长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

在利用前期基因型、幼穗长度、生长激素试验结果的基础上，初次切割时穗芽的长度对柳枝稷穗芽增殖效率有着显著的影响，且穗芽的增殖效率随着初次切割时穗芽长度的增加呈现出先升后降的趋势（表4）。初次切割穗芽长1.5cm时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，达到2 433.33%。方差分析表明，初次切割长度为1.5cm时的穗芽增殖效率与长度为1.0，2.0和2.5 cm的穗芽增殖效率间的差异达到极显著水平（P＜0.01）。因此，初次切割时期选择穗芽长度1.5cm较为理想。

表3 生长激素对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 3 Effects of phytohormone on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.5 大量培养阶段穗芽长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

在前期试验结果的基础上，大量培养阶段穗芽长度对增殖效率有着显著的影响，且穗芽的增殖效率随着穗芽长度的增加呈现出先大幅升高其后则呈降低的趋势（表5）。当穗芽长度为1.5cm时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，达到3 400.00%。方差分析表明，大量培养阶段柳枝稷穗芽长度为1.5cm时分离，其穗芽增殖效率与长度为1.0，2.0和2.5cm的穗芽增殖效率间的差异达到极显著水平（P＜0.01）。因此，大量培养阶段穗芽长度选择1.5cm进行增殖较为理想。

表4 初次切割时期穗芽长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 4 Effects of spike buds length of first cutting time on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.6 碳源对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

结合基因型、幼穗长度、生长激素、初次切割时期和大量培养阶段穗芽长度试验研究结果，培养基采用不同碳源对柳枝稷穗芽的增殖效率有显著的影响，其中以麦芽糖作为碳源时柳枝稷穗芽的增殖效率最高，为3 633.33%（表6）。经方差分析，麦芽糖、蔗糖和甘露醇3种碳源的培养基对柳枝稷穗芽增殖效率存在差异，其中碳源为麦芽糖的穗芽增殖效率显著高于蔗糖（P＜0.05），且极显著的高于甘露醇的穗芽增殖效率（P＜0.01），而碳源为蔗糖或甘露醇时两者之间差异不显著。因此在穗芽培养中选用麦芽糖作为碳源较为理想。

表5 大量培养阶段穗芽长度对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 5 Effects of spike buds length of mass culturing stage on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表6 碳源对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 6 Effects of carbon source on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.7 培养基pH值对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

在前期试验结果的基础上，培养基pH值对柳枝稷穗芽增殖效率有显著影响，增殖效率随着培养基pH值的升高呈现出先迅速升高后缓慢下降的趋势（表7）。在培养基pH为5.8时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，为3 766.67%。方差分析表明，培养基pH值为5.8时穗芽增殖效率与pH值6.0和6.2之间差异不显著，而极显著高于pH值为5.4和5.6时的穗芽增殖效率（P＜0.01）。因此，培养基pH值应控制在5.8～6.2时较理想，但以pH值为5.8时的增殖效率最好。

2.8 大量培养阶段穗芽块的切割方式对柳枝稷穗芽增殖效率的影响

在前期试验研究结果的基础上，切割方式采用纵切时，柳枝稷穗芽增殖效率最高，为4 166.67%（表8）。方差分析表明，采用纵切和横切2种切割方式时，幼穗增殖效率之间差异达到极显著水平（P＜0.01）。因此，丛生芽的切割方式以纵切最为理想。

表7 培养基pH对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 7 Effects of pH value on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.9 生根培养基对成苗的影响

良好的根系发育，是穗芽发育成苗乃至正常生长发育的基础。利用基因型、幼穗长度、激素、初次切割时期、大量培养阶段穗芽分离时期、碳源、pH值、穗芽块的切割方式试验研究结果，选择生长状态一致的穗芽，分别转至4种不同的生根培养基中，20d有不定根生成，45d后调查生根率。并将生好根的幼苗移栽至温室，2周后调查成活率。结果表明（表9），采用1／2MS作为生根培养基时，柳枝稷的生根率和移栽成活率均达到最大。因此，采用1／2MS培养基作为生根培养基较为理想。

表8 穗芽的切割方式对柳枝稷穗芽增殖效率的影响Table 8 Effects of cutting way on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

3 结论与讨论

植物组织培养增殖效率受到外植体类型、培养方式、基本培养基、植物激素组合和浓度等的影响。而植物材料的基因型是影响植物丛生芽诱导的一个重要因素，一般情况下，同属不同种之间丛生芽的再生率存在较大的差异，即使在同种不同品种间也有较大差异［20］。在本试验中，笔者通过对柳枝稷3种基因型幼穗离体再生研究，发现西稷1号基因型穗芽的增殖效率最高，证明在柳枝稷穗芽增殖过程中存在基因型决定增殖效率的现象。

表9 生根培养基对幼苗移栽成活率的影响Table 9 Effects of rooting medium on transplanting survival rate of seedling

在植物组织培养中，植物的器官分化决定于植物体内细胞分裂素和生长激素的比例，其中6－BA可以有效地诱导芽的萌发与不定芽的增殖，这是因为6－BA是一种高效的植物细胞分裂素，它调控细胞核基因的活性和蛋白质的磷酸化与翻译［21－23］。柳枝稷穗芽培养的成功与否也依赖于外源激素，6－BA和2，4－D在幼穗培养和穗芽组织块形成中起着十分重要的作用。在本试验中，以柳枝稷幼穗为外植体诱导穗芽的发生依赖于适宜浓度的6－BA，尤以6－BA 3.0mg／L为诱导培养基和增殖培养基效果最好。这与在黑麦草（Loliumperenne）、早熟禾（Poa pratensis）、翠竹（Sasapygmaea）、大花蕙兰（Cymbidium）等的研究结果相同［17，24－27］。另外，试验中还发现，在柳枝稷穗芽诱导和增殖培养基中，少量2，4－D的加入会提高柳枝稷的穗芽增殖效率，且2，4－D浓度为0.10mg／L时最理想。

碳源是植物组织培养中重要的营养源，它不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。近年来，各种糖类对植物组织培养的效应，引起广泛关注［28］。研究表明，不同植物对不同碳源种类的反应不完全相同［29］。在本试验中，不同碳源对柳枝稷穗芽的增殖效率由高到低依次是麦芽糖＞蔗糖＞甘露醇，麦芽糖虽比蔗糖高，但麦芽糖与蔗糖相比价格昂贵，从试验成本的因素来考虑采用蔗糖较为合适。

本试验以柳枝稷幼穗为外植体，依次从基因型、幼穗长度、激素、初次切割时期、大量培养阶段穗芽分离时期、碳源、pH值、穗芽块的切割方式和生根培养基等9个方面对柳枝稷人工穗芽再生体系进行了优化，初步建立起柳枝稷人工穗芽高效再生体系，该体系可用于柳枝稷遗传转化和细胞工程研究以及种质保存和快速繁殖。此外，该体系具有试验周期短、植株再生频率高、基因型约束较小和取材不受季节限制等优点。

本试验中柳枝稷人工穗芽再生体系是通过单因素寻优的方法获得的，没有综合考虑各因素间的相互作用，因此，下一步试验将采用正交旋转回归设计对初步获得的再生体系进行优化。

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