高效液相色谱法同时测定糕点中4种食用合成色素

米迎波黄 蔚刘 国唐序文

（1.怀化市质量技术监督局产商品质量监督检验所，湖南 怀化 418000；2.怀化市中方县质量技术监督局质量检验及计量检定所，湖南 怀化 418005）

高效液相色谱法同时测定糕点中4种食用合成色素

米迎波1黄 蔚2刘 国1唐序文1

（1.怀化市质量技术监督局产商品质量监督检验所，湖南 怀化 418000；2.怀化市中方县质量技术监督局质量检验及计量检定所，湖南 怀化 418005）

建立高效液相色谱法检测糕点中4种食用合成色素的新方法。用乙醇－氨水－水（体积比为7∶2∶1）混合溶液提取样品中的食用合成色素，聚酰胺层析柱进行净化。色谱柱：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈－乙酸铵溶液 （0.02mol/L），梯度洗脱，检测波长254nm。加标回收率为91%～103%。结果准确可靠，方法易于推广。

高效液相色谱；糕点；食用合成色素

食品色素是以调节食品色泽为目的的食品添加剂，又称食用染料或着色剂，分为天然色素和合成色素两大类，其中，合成色素因色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、价格低廉等特点而被广泛使用。最常用的合成色素有柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝5种，其中，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄均为偶氮类色素，有一定毒性，长期低剂量摄入，存在致畸、致癌性［1，2］；亮蓝为非偶氮类酸性染料，主要有3个同分异构体，一般为3个同分异构体的混合物（间位物∶对位物∶邻位物＝75～85∶15～20∶0～8）［3］。这5种合成色素通常被混合使用，检测方法上，目前大多数是5种色素同时检测［4－7］。中国允许使用的合成色素的种类正在逐渐减少，并对其使用范围和使用量做了严格的规定［8］。

为了加强食品质量安全监督管理，中国制定了食品中合成色素测定的标准方法 GB/T 5009.35——2003［9］，但未覆盖糕点类样品的预处理方法。该标准中规定的第一法是高效液相色谱法，流动相为甲醇－乙酸胺（0.02M），用梯度洗脱，对包括亮蓝在内的8个色素同时进行测定，甲醇含量在12min之内从20%增加到98%，变化跨度大，基线漂移大。亮蓝主要是3种同分异构体的混合物，有3个液相色谱峰，条件不同，出峰时间不同，与其他多种色素同时测定，存在干扰。本试验拟利用聚酰胺层析柱净化、反相高效液相色谱法分离，建立糕点中柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄4种合成色素的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

蛋糕、老婆饼、米花糖、绿豆饼：湖南省怀化市产商品质量监督检验所提供；

无机滤膜：0.45μm，上海密粒膜分离技术有限公司；

玻璃层析柱（2cm×30cm，配有烧结玻璃垫和聚四氟乙烯旋塞）：岛津国际贸易（上海）有限公司。

1.1.2 试剂

柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄标准物：0.5mg/mL，GBW（E），国家标准物质研究中心；

乙腈、甲醇：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；

聚酰胺粉：粒径0.075～0.15mm，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；

其他所用试剂：除另有规定外，均为分析纯试剂；

试验用水：超纯水。

1.1.3 仪器

高效液相色谱仪（内附二级管阵列检测器）：LC－20A，岛津国际贸易（上海）有限公司；

数控超声波清洗器：KQ3200DA，江苏昆山市超声仪器有限公司；

高速离心机：TC16－Ⅱ，长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱温25℃；流动相：A为乙腈，B为乙酸铵溶液 （0.02mol/L）；梯度洗脱（乙腈：0～5min，5%～15%；5～10min，15%～15%；10.01～18min，5%～5%）；流速1.0mL/min；进样量10μL；检测波长254nm。

1.2.2 标准曲线制作 将4种色素标准物用超纯水配成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/mL的混合标准使用液，在设定的色谱条件下，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

1.2.3 聚酰胺树脂预处理 取聚酰胺以90%～95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3～4倍体积的90%～95% 乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2～3倍体积5%的NaOH、3～4倍体积的蒸馏水、2～3倍体积的10%乙酸洗脱，最后用蒸馏水洗脱至中性，105℃条件下干燥，备用。

1.2.4 聚酰胺粉层析柱装配 将洗净的层析柱固定，关闭活塞。称取经预处理过的聚酰胺粉2～3g（称准至0.01g）于100mL的小烧杯中，加适量的水，用玻璃棒搅拌片刻，然后边搅拌边装入层析柱中，用水洗下柱内壁的树脂，最后用吸耳球轻敲层析柱，使树脂层高度为3cm左右，并且较为紧密，打开旋塞，使水流出到树脂顶部约0.5～1cm，关闭旋塞。层析柱出口与抽滤瓶导管（1 000mL，配单孔橡胶塞，孔中插有玻璃导管）、抽滤瓶与真空泵均用硅胶管连接，形成完整的抽滤系统。

1.2.5 样品处理 准确称取已粉碎均匀的糕点样品5g（精确到0.000 1g）于50mL比色管中，加入40mL乙醇－氨水－水混合溶液（体积比为7∶2∶1），混匀并且超声20min，室温静置10min，定容至刻度，摇匀，离心（6 000r/min以上），滤纸过滤，准确取20mL滤液于100mL小烧杯，用50%柠檬酸溶液调节pH至4～5，移入层析柱，用水洗烧杯2～3次，洗液移入层析柱；打开层析柱旋塞，启动真空泵，使色素很快吸附到树脂上成一色素环带，用pH 4～5的水及甲醇－甲酸混和液（6＋4）洗涤2～3次，除去天然色素，再用水洗涤2～3次，关闭真空泵，弃去洗涤液；在抽滤瓶中放1支25mL的比色管，用来接收解吸液；连接并启动真空泵，用乙醇－氨水溶液解吸树脂上的色素，解吸3次，每次5～6mL；关闭真空泵，倒出解吸液于50mL蒸发瓶，挥发至干，加水2mL，把残渣充分溶解，用滤膜过滤，滤液供分析用。

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件的选择

（1）准确称取粉碎的试样5g（准确至0.000 1g）于50mL比色管中，加40mL水，超声20min，室温静置10min，定容、混匀、离心和过滤，取20mL滤液，用50%柠檬酸溶液调节pH至4～5，其余步骤按1.2.5操作，同时进行加标回收，结果见表1。

（2）准确称取粉碎的试样5g（准确至0.000 1g）于50mL比色管中，加40mL水，超声20min，室温静置10min，加沉淀剂乙酸锌（220g/L）、亚铁氰化钾 （106g/L）各2mL，其余步骤按1.2.5操作，同时进行加标回收，结果见表1。

（3）按1.2.5方法进行样品处理，获取试样溶液，上机分析，同时进行加标回收，结果见表1。

表1 不同样品处理方法的测定结果Table 1 The determination result by different processing method

由表1可知，用方法2.1（1）和2.1（2）进行样品处理，结果不符合要求，糕点水溶液中，色素一定程度被淀粉和沉淀剂凝聚物吸附，因此，水不能作为糕点中4种色素的最佳提取液；用方法1.2.5处理样品，4种色素的回收率高，说明乙醇－氨水－水混合溶液 （体积比为7∶2∶1）是最佳提取液。另外，按GB/T 5009.35——2003标准操作，用 G3垂融漏斗抽滤净化和洗脱目标色素，易产生堵塞现象；而用聚酰胺层析柱进行净化，在层析柱内有环形色带形成，解吸时，环形色带向下移动，现象明显，操作方便。

2.2 流动相的选择

由于4种色素虽然均为偶氮类色素，但结构不同，等度条件下分离效果不理想。GB/T 5009.35——2003中的梯度洗脱条件跨度最大为78%甲醇，基线噪声大。本试验研究了乙腈－0.02M乙酸铵溶液的3个梯度洗脱条件，分离0.05mg/mL的混合标样，3个梯度洗脱条件分别是① （乙腈：0～10min，10%～30%；10～15min，30% ～10%；15.01～20min，10%～10%）、② （乙腈：0～5min，15%～35%；5～10min，35%～35%；10.01～20min，15%～15%）和③ （乙腈：0～5min，5%～15%；5～10min，15%～15%；10.01～18min，5%～5%），结果见表2。条件①下只有3个峰，日落黄不出峰；在条件②和③下，4种色素能很好地分离，但条件③下的灵敏度最高，噪声和基线漂移最小。从试验结果看，梯度跨度越小，噪声和基线漂移越小，反之亦然。因此选择条件③为方法条件。4种色素的标准色谱图见图1。同时在该条件下进行样品测定，根据二极管阵列光谱扫描图进行目标峰定性，样品色谱图见图2。

表2 同一标样不同梯度洗脱条件的测定结果Table 2 The determination result under different gradient condition for the same standard

图1 4种色素标准色谱图Figure 1 Chromatogram of 4Synthetic Pigment standard

图2 样品色谱图Figure 2 Chromatogram of Sample

2.3 标准曲线和方法检出限

各标准物质曲线回归方程、相关系数及方法检出限见表3。由表3可知，各标准物质浓度在0.01～0.05mg/mL时，浓度和峰面积有良好的线性关系，相关系数均大于0.999，同时做空白试验，检出限以噪音的3倍计算。结果说明方法灵敏。

表3 4种色素的标准曲线回归方程、相关系数及检出限Table 3 That of curvilinear equation，correlation coefficient and detection limit for 4Pigment

2.4 加标回收率和精密度试验

向不含色素本底值的试样中加一定量的混合标样，按1.2.5方法进行测定，考察方法的回收率，以0.05mg/mL添加水平的试样重复测定7次，考察方法的精密度，结果见表4。结果说明方法准确可靠。

表4 加标回收率和精密度试验结果Table 4 The test result of recovery and precision

3 结论

（1）本试验对GB/T 5009.35——2003《食品中合成着色剂的测定》进行了优化改进，建立了高效液相色谱检测糕点中食用合成色素的新方法。通过试验比较，发现乙醇－氨水－水混合溶液 （体积比为7∶2∶1）是糕点中食用色素的最佳提取液，水很难完全提取其中的食用色素，不能作为提取液；聚酰胺层析柱是色素提取液的最佳净化工具，现象直观明了，优于用G3垂融漏斗净化；用乙腈－0.02M乙酸铵溶液梯度洗脱条件对4种色素的分离效果好，基线漂移小，而按中国国标方法用甲醇－0.02M乙酸铵溶液梯度洗脱条件进行多种色素分离，分离效果差，基线漂移大；本方法加标回收率为91%～103%，相对标准偏差均小于5%，符合标准检测方法要求。

（2）本试验建立的新方法简单可靠、准确可行，结果令人满意。

（3）亮蓝为3种同分异构体混合物，不适合与以上4种色素同时检测。食品中亮蓝的测定有待下一步研究。

1 陈国庆，吴亚敏，王俊，等.常用合成食品色素荧光光谱研究［J］.光谱学与光谱分析，2009，29（9）：2 518～2 522.

2 刘成伦，李小庆，王晶，等.偶氮类非食用色素的快速测定方法研究进展［J］.食品科学，2009，30（5）：273～276.

3 丁秋龙，王丽斌，陈建新.食用亮蓝色素之同分异构体研究［C］//中国化工学会.第九届全国染料与染色学术研讨会暨信息发布会论文集，2004：76～78.

4 陈艳，刘思洁，李皓.高效液相色谱法测定果冻中的合成色素［J］.食品科学，2007，28（9）：487～490.

5 倪蓉，杨龙彪，张燕.高效液相色谱法同时测定果味饮料中8种添加剂［J］.中国卫生检验杂志，2006，16（10）：1 196～1 197.

6 陈夏芳，胡浩军，李韬.高效液相色谱法测定肉制品中人工合成色素的研究［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（2）：313～314.

7 邢晓慧，尹未华，韩春菊，等.高效液相色谱法测定蜜饯中食用合成色素［J］.食品研究与开发，2007，28（10）：133～135.

8 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB 2760——2007食品添加剂使用卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2008.

9 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.35——2003食品中合成着色剂的测定［S］.北京：中国标准出版社，2004.

Determination of 4 synthetic pigment in cake product by high performance liquid chromatography

MI Ying－bo1HUANG Wei2LIU Guo1TANG Xu－wen1

（1.Department of Product or Commodity Quality Testing and Supervising，Huaihua Bureau of Quality and Technical Supervision，Huaihua，Hunan418000，China；2.Department of Quality Inspection and Measurement Calibration，Zhongfang County Bureau of Quality and Technical Supervision，Huaihua，Hunan418005，China）

A new analytical method was developed for determination for 4synthetic pigment in cake product by high performance liquid chromatography（HPLC）.The synthetic pigment in cake product in samples was extracted by ethanol－ammonia water－water（volume ratio 7∶2∶1），and it was purified by polyamide chromatography column.The HPLC conditions：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm），acetonitrile－0.02mol/L ammonium acetate solution as mobile phase，gradient elution and UV detection at 254nm.The average recoveries were 91%to 103%.The result is accurate and easy to spread.

HPLC；cake product；synthetic pigment

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.021

米迎波（1970－），男，怀化市质量技术监督局工程师。E－mail：myb70＠126.com

2011－04－15