西洋参悬浮细胞的超低温保存研究

李亚璞，张小兵，闫静辉

（河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081）

西洋参悬浮细胞的超低温保存研究

李亚璞，张小兵，闫静辉＊

（河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081）

对西洋参悬浮细胞的超低温保存进行了初步的研究，结果表明，首先将西洋参悬浮细胞在含8%蔗糖的西洋参液体培养基中预培养2天，然后经过10%DMSO＋8%萄葡糖的冷冻保护剂处理，以4℃（60min）、0℃（30min）、－20℃（2h）、－70℃（30min）的降温程序处理，最后投入液氮中，西洋参悬浮细胞可以生长为愈伤组织，且愈伤组织长势旺盛。

西洋参；悬浮细胞；超低温保存

西洋参（Panax quinquefolium）是五加科（Araliaccae）多年生草本名贵药材，原产于北美洲，一般需4－6年才能收获入药，其有效成分是人参皂甙，具有强心、镇定等功效。组织培养技术应用于西洋参是解决其皂甙资源供应不足的一条有效途径［1］。但是在植物组织和细胞的长期培养过程中，不断的继代培养可能会引起染色体和基因型的变异，导致植物的一些宝贵的特殊性状的丢失。利用液氮（－196℃）超低温冻存是进行植物组织和细胞长期、稳定保存的一种有效方法。在液氮低温条件下，所有的细胞分裂和代谢活动停止，植物材料在超低温保存过程中应该不会产生遗传性状的改变。因此它不仅可以解决组织、细胞培养过程中的变异问题，还可用于长期保存植物培养物的优良株系［2，3］。该项工作始于20世纪70年代，迄今为止，国内外已对近200种植物材料进行了超低温保存实验的研究。但是，关于药用植物超低温保存的研究还很缺乏，这种技术已在银杏［4］、红景天［5］、三分三［6］等药用植物的离体培养物种质保存中获得了成功，但有关西洋参组织或细胞的超低温保存研究少见报道。本文在西洋参悬浮细胞培养的研究中，开展了对西洋参悬浮细胞超低温保存的初步尝试。

1 材料和方法

1.1 材料

本室经过多次筛选获得的优质西洋参悬浮细胞系，选择处于旺盛对数分裂期的悬浮细胞作为冷冻材料。

1.2 方法

（1）预培养：在无菌条件下，将冷冻材料分为两部分，一部分材料转入到含8%蔗糖的西洋参液体培养基中预培养1、2、3天，另一部分材料未经预培养作为对照。

（2）冷冻保护剂处理：参考文献［7］，本次实验优化设计了5种组合的冷冻保护剂：①10%DMSO＋8%葡萄糖；②10%DMSO＋8%蔗糖；③10%DMSO＋10%葡萄糖；④10%DMSO；⑤对照组。将西洋参悬浮细胞分别置于冷冻保存管中，加入预冷的冷冻保护剂，使之浸没细胞，密封保存管，静置预处理30min.

（3）降温冷冻处理：将冷冻保护剂处理的材料经过以下3种方式的降温冷冻处理后投入液氮中保存。①0℃→LN（液氮）；②0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）；③4℃（60min）→0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）。

（4）解冻和洗涤：实验材料在液氮中冻存7天后，然后将材料从液氮取出，采用37℃水浴化冻。待冷冻管内的冰刚融化，立即加入正常的西洋参液体培养基进行冲洗，吸去培养液，同样的方法洗涤三次，每次停留5min。冷冻保护剂对植物细胞可能存在毒害作用，解冻后的植物材料在培养之前应除去冷冻剂。

（5）冷冻保存后细胞的恢复生长：将冷冻材料转移到西洋参固体培养基上进行再培养，在再培养过程中，观察愈伤组织恢复生长的时间及生长状况，35天测定生长速率。（生长速率＝收获的愈伤组织量／接种的悬浮细胞量＊100%）

2 结果和分析

2.1 不同预培养时间条件下西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

本实验将西洋参液体培养基的糖浓度提高到8%作为预培养基，然后将西洋参悬浮细胞经过预培养1、2、3天，再经过相同的冷冻保护剂处理和降温程序处理，结果见表1。由表1可以看出，与对照相比，经过预培养处理的悬浮细胞，其愈伤组织出现时间早，生长速度快。可见，预培养对西洋参悬浮细胞的超低温保存有一定的影响。但是，预培养1、2、3天没有显著区别。这可能是将培养基的糖浓度提高对细胞的抗冰冻能力有一定的影响，从而使细胞的存活率得到提高。

表1 不同预培养时间条件下西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

2.2 不同冷冻保护剂组合条件下西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

选择预培养2天的西洋参悬浮细胞作为研究对象，经过不同的冷冻保护剂处理后，结果差异较大。由表2可以看出，经过10%DMSO＋8%葡萄糖冷冻保护剂组合处理的西洋参悬浮细胞出现愈伤组织时间早，愈伤组织形态较好，生长速率最高；其它几种组合的冷冻保护剂效果较差，没有经过冷冻保护剂处理的对照组没有表现出愈伤组织的生长。可见，冷冻保护剂处理是西洋参悬浮细胞超低温保存的关键步骤。

表2 不同冷冻保护剂组合条件下西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

2.3 不同冷冻降温程序处理西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

冷冻降温程序处理对西洋参悬浮细胞的影响见表3。由表3看出，降温程序对西洋参悬浮细胞的超低温保存影响差异较大。采用分步冷冻法，西洋参悬浮细胞的成活率较高，出现愈伤组织的时间较早，愈伤组织形态较好，生长速率较高。经过4℃（60min）预处理，西洋参愈伤组织生长速率最高。直接从0℃投入液氮保存的西洋参悬浮细胞，其冻后出现愈伤组织的时间较晚，愈伤组织褐变严重，基本上没有生长。在超低温保存中，预冻的目的是使细胞内的水分脱出，形成对细胞结构损伤不大的细胞外结冰，这样就可以避免细胞内结冰对原生质的损害。结果表明，细胞经过分步降温要比一步直接投入液氮中对细胞的伤害小。从0℃直接投入液氮，对西洋参悬浮细胞的超低温保存是不适宜的，悬浮细胞复苏后细胞活力太低，而在分步降温过程中，在4℃环境中停留1 h预冻要比直接从0℃预冻的效果好。

表3 不同冷冻降温程序处理下西洋参悬浮细胞的恢复生长情况

3 讨论

超低温（－196℃）保存是目前长期而稳定地保存植物种质资源的最好方法，在液氮低温下，所有的细胞分裂和代谢活动停止，因而植物材料在超低温保存过程中不会产生遗传性状的改变。除一些对脱水不敏感的材料以外，几乎所有的植物材料都需经过冰冻保护剂处理，超低温保存后都能存活。到目前为止，利用超低温保存的植物材料涉及到悬浮细胞、原生质体、愈伤组织、茎尖、芽、花粉、胚或体胚、种子等，大部分已成功地实现了植株再生［8］.

本试验表明，冷冻保护剂处理和降温程序处理在西洋参悬浮细胞的超低温保存中起着关键的作用。西洋参悬浮细胞的超低温保存中较好的冷冻保护剂组合是10%DMSO＋8%葡萄糖，较好的冷冻降温程序是4℃（60min）→0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）。文献［9］提出，超低温保存材料在化冻时，再次结冰的危险温度区大约是－5～10℃，因此化冻一般在30～40℃温水浴中进行，借助迅速的化冻速度通过此温区，避免细胞内次生结冰对细胞的破坏。实验证明，本实验对保存材料直接采用37℃水浴化冻是可行的。

目前，国内外关于西洋参超低温保存的研究较少，仅有张连学等［10］对西洋参花粉超低温保存的研究报道。超低温保存是一个非常复杂的过程，不同植物和同一植物不同类型的材料，其超低温保存的难易可能有不同，因此一定要根据植物材料不同的特性，对影响超低温保存的因素进行研究。

本文对西洋参悬浮细胞的超低温保存做了初步的探索性研究，仅是从形态学方面对生成的愈伤组织进行了观察，结果表明：西洋参悬浮细胞经过一定时间的预培养，然后经过合适的冷冻保护剂处理和冷冻降温程序处理，西洋参悬浮细胞可以生长为愈伤组织，证明了西洋参悬浮细胞的超低温保存是可行的。这就为西洋参悬浮细胞的保存提供了一条新途径，从而解决了长期继代保存的繁琐性，减轻了工作量。但是种质保存的根本目的是为了保持植物遗传基因的稳定及所控制的遗传性状不发生变化，这就要从细胞学和生理、生化方面对其进行测定。细胞学主要鉴定染色体数目和结构的变化；生理、生化方面主要采用同工酶谱分析和RFLP、RAPD、AFLP等分子生物学技术进行鉴定。另外，选择的冻存材料及其所处的生长状态，其它的冷冻保护剂组合和化冻方式以及在液氮中的冻存时间都是西洋参悬浮细胞超低温保存的影响因素，因此对西洋参悬浮细胞的超低温保存还需做更深入的研究。

［1］闫静辉，张小兵，李亚璞，等，西洋参细胞培养的研究进展［J］.河北省科学院学报，2006，23（2）：79－83.

［2］Matsumoto T，Mochida K，Itamura H，et al.Cryopreservation of persimmon（Diospyros kaki Thunb.）by vitrification of dormant shoot tips.Plant Cell Rep，2001，20：398－399.

［3］Sakai A，Kobayashi S，Qiyama I.Cryopreservation of nucellar cells of navel orange（Citrus sinensis Osb.var.brasiliensis Tanaka）by vitrification.Plant Cell Rep，1990，9（1）：30－33.

［4］徐刚标，易文，李美娥，等.银杏愈伤组织超低温保存的研究［J］.林业科学，2001，37（3）：30－34.

［5］郭燕霞，刘玉军.长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究［J］.西北植物学报，2006，26（8）：1605－1611.

［6］郑光植，何静波，王世林.三分三愈伤组织及其悬浮细胞的冰冻贮藏［J］.植物学报，1983，25（6）：513－517.

［7］罗士韦，唐惕.植物组织和细胞的超低温保藏及其种质库建立的研究现状［J］.细胞生物学杂志，1983，5（1）：1－7.

［8］邓旭，雷新涛，成明昊.超低温保存果树种质资源研究进展［J］.热带农业科学，2006，26（4）：50－54.

［9］陈品良.植物组织培养物的超低温保存［J］.武汉植物学研究，1989，7（4）：390－398.

［10］张连学，常维春，魏云洁，等.人参、西洋参花药超低温保存对花粉存活的影响［J］.植物学通报，1993，10（2）：58－59.

The study on cryopreservation technique for Panax quinquefolium

LI Yapu，ZHANG Xiao－bing，YAN Jing－hui

（InstituteofBiology，HebeiAcademyofSciences，ShijiazhuangHebei050081，China）

The cryopreservation for suspension cells of panax quinquefolium is studied.The result shows that it is probable for the cryopreservation for suspension cells of panax quinquefolium.First，they are precultured for 2 days in MS with 8%Sucrose，and cryoprotectants processing with 10% DMSO and 8%Glucose，and are freezed with 4℃（60min）、0℃（30min）、－20℃（2h）、－70℃（30min），they were immersed immediately into liquid nitrogen directly at last.They can regenerate calli showing vigorous growth.

Panax quinquefolium；Suspension cells；Cryopreservatio

Q418

：A

1001－9383（2011）04－0032－04

2011－05－25

李亚璞（1980－），女，助理研究员，研究方向：细胞工程.

闫静辉