抗肿瘤的海洋微生物筛选

朱 兰，何 伟，许书宁，周静雯

(大连民族学院环境资源学院学生，辽宁大连 116605)

抗肿瘤的海洋微生物筛选

朱 兰，何 伟，许书宁，周静雯

(大连民族学院环境资源学院学生，辽宁大连 116605)

本研究利用人体宫颈癌细胞(Hela细胞)为靶细胞，在大连近海12种海洋动植物体内提取微生物。用4种分离培养基培养，分离并得到48株海洋微生物。对单菌落进行发酵，获得其次生代谢产物。随后，进行海洋微生物的发酵次生代谢产物的抗肿瘤鉴定［1－5］，研究结果发现，有1种菌株(12#－从黑泥中用MD培养基筛选的菌)发酵液对Hela细胞有较强的抑制作用，6种菌株发酵液有轻微的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

微生物分离培养材料取自大连近海的海泥、海水、鱼类等12种样品;肿瘤细胞为Hela细胞。

1.2 仪器及试剂

仪器:Vs—1300型洁净工作台、28℃RXZ—300B型培养箱、37℃MJ—180B型生化培养箱、MLS—3020高压灭菌器、ZHWY－221B新型大容量全温度恒温培养震荡器、动物细胞培养箱。

试剂:葡萄糖、海水、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、SDS、孟加拉红、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏、可溶性淀粉、胎牛血清等。

1.3 方法

(1)在无菌操作台上称取2～4 g从海边采集的样品放入灭菌的小烧杯中，用无菌剪剪碎，无菌量筒称取10倍的无菌海水，将样品和海水一起倒入无菌三角瓶中，旋涡振荡10 min，使其充分混悬制成悬浊液。取8 mL悬浊液于无菌离心管中，取2 次，离心振荡 10 min，转速为 1 500 r·min－1，离心后，取上清液备用。

(2)稀释涂布平板法。将上述上清液与无菌陈海水按体积比1∶9 稀释成10－3，10－4，10－5，10－6质量浓度，吸取10 μL，分别放入查氏培养基(Cha)、牛肉膏蛋白胨培养基(NRG)、高氏一号培养基(G1)、马丁氏培养基(MD)(分别培养霉菌、细菌、放线菌、真菌)平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30 min后置于30℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态，检查其特征是否一致。若发现有杂菌，需进一步分离，纯化，直至获得纯菌落。

(3)菌种发酵。从斜面取活化培养的单菌落适量，分别接种到三角瓶中(每瓶30 mL发酵培养液)，于28℃振荡摇床中 120 r·min－1振荡培养10 d，发酵液备用测活。

(4)发酵产物抗肿瘤活性鉴定。将发酵液按照1∶50的体积比，即5 mL人体宫颈癌细胞培养液中放入100 μL的发酵液(不同时间取一个空白对照)再放入CO2培养箱中测活。抑制后从CO2培养箱中取出6孔板，用镊子夹出玻璃片，放在搁物架上晾干，待完全干后进行染色。

(5)显微观察。在显微镜下观察细胞形态特征以及数目，如细胞缩小，核质固缩聚集，形成小体及吞噬现象等。取附着有发酵培养液物质处的区域进行记数，用“+”表示抑制的强弱。

2 结果与讨论

2.1 样品测定的结果

筛选的单菌落对人体宫颈癌细胞(Hela细胞)的抑制结果见表1。

表1 单菌落对人体宫颈癌细胞(Hela细胞)的抑制结果

2.2 讨论

从测定结果可以得出:48种单菌株发酵液中，有一种菌株对肿瘤细胞有较强的抑制作用，6种菌珠有轻微的抑制作用，其余菌珠对肿瘤细胞没有抑制作用。

3 结语

综上所述，海洋微生物是一个巨大的尚待开发的资源。海洋微生物数量大，种类多，随着人类对海洋微生物认识的加深，对海洋微生物活性物质研究的深入，一定可以从中发现更多高效低毒的海洋微生物抗肿瘤新药，使海洋微生物活性物质为人类做出更大贡献。

［1］王正平，张庆林，胡艳红.海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究进展［J］.海洋科学，2002，26(8):28 －30.

［2］李越中，陈琦.海洋微生物资源及其产生生物活性代谢产物的研究［J］.生物工程进展，2000，20(5):28 －31.

［3］李利君，蔡慧农，苏文金.海洋微生物生物活性物质的研究［J］.集美大学学报:自然科学版，2000，5(2):80－86.

［4］刘志鸿，程力，牟海津.海洋微生物活性物质的研究概况［J］.中国水产科学，1999，6(4):99－103.

［5］林永成，周世宁，乐长高.海洋微生物活性代谢产物化学［J］.大学化学，1996，11(6):5.

Q93－33

A

1009－315X(2011)05－0524－02

2011－06－20;最后

2011－07－04

指导教师:姜健(1970－)，男，内蒙古通辽人，教授，博士，主要从事细胞生物学研究;杨宝灵(1969－)，女，内蒙古通辽人，高级工程师，主要从事生物学研究。

(责任编辑 邹永红)