基于核酸适配体－荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

陈伶利 ，李 杰 ，贺气志 ，陈 辉 ，毛平道 ，邓 乐 *

（1.湖南师范大学生命科学学院，湖南 长沙 410081；2.湖南中医药大学基础医学院，湖南 长沙 410208）

基于核酸适配体－荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

陈伶利1,2，李 杰2，贺气志1，陈 辉1，毛平道1，邓 乐1*

（1.湖南师范大学生命科学学院，湖南 长沙 410081；2.湖南中医药大学基础医学院，湖南 长沙 410208）

目的 利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系，建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法 利用ATP核酸适配体双链DNA（dsDNA）和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用，实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果 反应体系在12℃，pH 7.5条件下具有最佳实验效果，在最优条件下，最低能检测10-6mol/L的ATP，并具有较高的特异性。结论 本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。

核酸适配体；EvaGreenTM；ATP；检测

腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine-triphosphate,ATP)在生物体与外界进行物质和能量交换的过程中，起着重要的桥梁、纽带作用，它是生物体各种生命活动能量的直接来源，因此在很多的生物反应检测中ATP是一项重要的检测内容[1-2]。目前，检测ATP的方法主要有电泳法、光学分析法、层析法、生物发光法(荧光素酶法)等，但是以上方法操作复杂、费时，且灵敏度不高；2009年 Li W等人提出用金纳米粒子来检测ATP，可以检测到1～10mmol/L的ATP，大大提高了检测灵敏度，但此方法需要制备特异的核酸修饰的金纳米探针，检测成本较高[3]。Huizenga和 Szostak于1995年通过SELEX技术筛选出ATP/Adenosine适配体[4]，基于适配体技术的检测研究受到了极大的关注[5-7]。2008年Zhang Chen等将量子点标记的适配体生物传感器用于ATP检测[8]，2009年孙波等用高灵敏适配体电化学发光生物传感器来检测血样中的ATP[9]，但是这些方法需要使用特殊试剂，分析成本较高。染料Eva GreenTM是一种绿色荧光核酸染料，它有良好的热稳定性和水解稳定性，为常规操作提供了便利，而Eva GreenTM本身没有荧光，与dsDNA嵌合后能发出高亮度的荧光，但当dsDNA转化为ssDNA后荧光强度将大大减弱。与荧光核酸染料SYBRTM GreenⅠ相比，E-va GreenTM可以在更高浓度下使用，从而产生更强的扩增信号[10-12]。

本研究以ATP为目标分析物，以核酸适配体-ATP的特异性识别与dsDNA与荧光染料Eva GreenTM的嵌合作用为基础，发展了一种简单、灵敏的荧光检测新技术。由于Eva GreenTM与dsDNA嵌合后能发出高亮度的荧光，但与ssDNA结合后荧光强度大大减弱。利用核酸适配体-ATP复合物的形成所引起的荧光值变化来检测ATP。实验结果表明，本方法操作简单，不需要对样品进行处理，检测所需时间短，整个检测过程可以在40min内完成。同时具有较高的灵敏性、较强的特异性，最低检测下限为10～6 M;该方法的建立为ATP的分析检测提供了新的技术支持。现将方法与结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 LS50B型荧光分光光度计（PerkinElmer，美国）。

1.1.2 试剂 染料Eva GreenTM购自北京美莱博医学有限公司 （Biotium，美国，20×），使用时稀释20倍；ATP、GTP、CTP、UTP购自上海生物工程技术服务公司（BBI公司）；实验用水均为超纯水；缓冲液为0.01moL/L 磷酸缓冲液 （PBS，pH 6.0～8.0）， 均为115℃灭菌20min，冷却后备用；所有序列（表1）均由上海生工生物工程技术服务公司合成，PAGE纯化。

表1 ATP核酸适配体序列表

1.2 实验原理

本实验的分子识别与检测原理如图1所示：利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建了基于核酸适配体的ATP检测体系。由于绿色荧光染料Eva GreenTM与dsDNA的嵌合作用，系统产生较强的荧光信号。当dsDNA与ATP孵育后，ATP能识别其特异适配体，并形成适配体－ATP复合物，使DNA双链解链，嵌合的荧光染料Eva GreenTM得以释放，从而导致系统荧光信号骤然减弱，通过检测系统荧光信号变化强度可定量测定ATP的浓度。

图1 核酸适配体-ATP复合物荧光信号传感技术原理示意图

1.3 方法

1.3.1 dsDNA制备 取10μmol的ATP核酸适配体溶液与10μmol/L的互补序列等量混和，4℃过夜，即得10μmol/L的含ATP适配体的dsDNA。

1.3.2 适配体与ATP相互作用 取10μmol的dsDNA 5 μL于1.5 mL EP管中，再分别加入0.01moL/L PBS（pH 7.5）589 μL，不同浓度 ATP 6 μL，对照管以等体积PBS代替ATP。于12℃孵育1 h。

1.3.3 荧光值的检测 分别取与ATP孵育后的溶液及对照管溶液各197.5 μL，并加入 2.5 μL Eva GreenTM，振荡10min后在荧光分光光度计上分别测其荧光值，调激发波长为490 nm，发射波长为525 nm。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 孵育温度对于荧光强度的影响

反应温度对适配体与ATP的结合能产生一定的影响。将dsDNA与ATP反应体系置于不同温度下反应，检测荧光信号变化值，确定该反应的最佳孵育温度。室温（约12℃）为最佳的孵育温度。温度较低或较高时，dsDNA的解链不完全，与其嵌合的荧光染料Eva GreenTM释放量少，从而检测到的荧光信号变化不显著，见图2。

2.2 不同pH值对于荧光强度的影响

图2 孵育温度对荧光影响强度的柱形分析图

在反应体系中，不同的pH值的PBS缓冲液对荧光强度的检测也具有显著的影响。在空白荧光为489.38 的条件下，pH 6.0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.3、7.5、8.0所测得的荧光值分别为 358.02、288.04、276.34、266.83、236.64、183.26、226.04 au,实验重复 3 次，取平均值。该结果表明：pH值为7.5时，反应检测所得的荧光强度最低，即荧光变化值最大，说明在pH 7.5时，缓冲液对反应体系的影响最小。这是因为荧光强度的变化决定于Eva GreenTM的释放量，而Eva GreenTM的释放量又受适配体－ATP结合程度的影响，而pH值能够影响适配体－ATP复合物的解离，在pH 7.5时，适配体－ATP复合物的解离程度最小，因此该pH是本反应体系的最适值，见图3。

图3 pH值对荧光强度检测影响的散点分析图

2.3 线性范围及检出下限

考察了ATP的浓度对于反应体系荧光信号检测的影响。在空白荧光为489.38，背景信号为13.57的条件下，随着ATP浓度的减小，所测得的荧光信号与空白对照的变化值越来越小，当ATP浓度为10-7mol/L时，所测结果与10-6mol/L变化很小，趋近为零，说明对10-7mol/L的检测无意义，见图4。

2.4 ATP特异性检测

图4 ATP浓度对于荧光强度影响的散点分析图

为了检验本体系对ATP检测的特异性，实验还考察了不同浓度的其他同类型NTP分子，即CTP、GTP、UTP分子。将NTP分子与实验所用的核酸适配体在相同条件下反应，并检测它们的荧光信号变化值。实验测得dsDNA的起始荧光强度为481。通过4组不同浓度NTP分子检测结果的对比，随着浓度的变化，对照组CTP、GTP、UTP的荧光信号有缓慢上升的趋势，但变化不明显。这是因为CTP、GTP、UTP在结构上与ATP存在一定的相似性，能与ATP适配体存在一定程度的结合，因而释放出少量的染料，使荧光信号出现少量变化。而在实验组随着ATP浓度的减小，荧光强度有明显增大，也就是说随着ATP浓度的减小，荧光信号变化值也变小。以上结果说明本实验建立的荧光传感技术对于ATP分子检测具有较高的特异性，见图5。

图5 ATP特异性检测折线图

3 讨论

本研究基于核酸适配体-ATP复合物与绿色荧光染料Eva GreenTM作用，建立了荧光信号检测技术的新方法。

本研究优化了核酸适配体与ATP结合反应的实验条件。实验结果可知，核酸适配体与ATP反应的最适温度为12℃；pH值为7.5时，荧光检测结果最灵敏；在最优化的实验条件下，随着ATP浓度的减小，所测得的荧光信号与空白对照的变化值变小，当 ATP 浓度从 10－6mol/L 到 10－2mol/L 变化，对应的荧光强度随着浓度的减小而增大，呈现一定的线性关系。因此可作为该范围浓度的ATP检测新方法。体系还对该方法的特异性作出了探讨，采用与ATP同类型分子CTP、GTP、UTP作为对照，根据检测出的结果证实该核酸适配体对与ATP分子的检测具有较强的特异性。

本研究所建立的基于核基于核酸适配体-ATP特异识别的荧光传感技术，对于ATP分子的检测相较于其他的检测方法，不仅反应体系特异性高，并且实验操作简单，耗时少，成本低。可见，本研究为之后的分子识别检测提供了更为坚实的基础。

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Study of rapid detecting ATP based on aptamer and DNA-specific dye EvaGreenTM

CHEN Ling-li,LI Jie,HE Qi-zhi,CHEN Hui,MAO Ping-dao1,DENG Le
(College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha,Hunan 410081,China)

Aptamer;Eva GreenTM;ATP;detection

Q-331

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.002.006.04

〔Absrract〕Objective To develop a simple,efficient fluorescence detection technology for ATP.Methods The DNA-intercalating dye Eva GreenTMaptamer-ATP complex was used to detect quickly ATP.The effects of temperature,concentration,pH and reaction time were studied.Results The reacting system was that the best temperature and pH were 12℃and pH7.5,The ATP at limitation 10～6moL/L was detected with optimized conditions.Conclusion This research provides a kind of easy operation and low cost method for ATP rapid detection.

2011－01－06

国家科技部863计划资助项目（2007AA062Z403）。

陈伶利（1979－），女，湖南株洲人，博士，主要从事病原微生物检测技术研究。

*邓 乐，男，教授，博士研究生导师，E-mail：dengle@hunnu.edu.cn。

（本文编辑 彭芝配）