交联透明质酸钠凝胶的制备工艺研究

王艳果，傅经国，郭利兵

（河南科学院化学研究所，河南 郑州450002）

交联透明质酸钠凝胶的制备工艺研究

王艳果，傅经国，郭利兵

（河南科学院化学研究所，河南 郑州450002）

以细菌发酵透明质酸（HA）为原料，在室温条件下采用二乙烯基砜（DVS）交联剂制备DVS-HA凝胶，为去除未反应的交联剂进行多方案实验，通过气相色谱法检测凝胶中残留交联剂含量，以期获得较优工艺方案，为进一步开发HA临床应用产品奠定了基础。

交联透明质酸钠;二乙烯基砜;气相色谱法

透明质酸（hyaluronic acid HA）是一种从动物组织提取的天然阳离子多聚糖，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替排列构成的长链高分子，具有良好的亲水性、黏弹性、润滑性。但在临床医学中发现天然HA易被生物降解，硬度和力学强度不够大，限制了HA的应用[1]。将天然HA进行交联可得更大交联网状结构的衍生物，其化学和力学性能比HA更稳定且具有生物相容性和生物降解性，对人体无毒、无刺激作用，大大拓宽了HA的临床应用领域，尤其是获得新型医用生物材料方面，如防术后粘连材料、软组织填充材料、新型药物缓释基质、美容和整形填充物等[2]。

使用二乙烯基砜（DVS）作为交联剂制备HA衍生物是众多制备交联HA的方法之一。早在20世纪80年代，Balazs成功制备得到了交联HA凝胶。但是，DVS-HA凝胶中可能残留有交联剂DVS，而DVS是对机体有害的物质，是引起临床不良反应的主要成分，不利于应用于生物体内，所以必须对其进行去除[3~4]。本文通过不同实验方案去除交联剂DVS，对其工艺技术进行探讨研究，作为开发HA临床应用产品的基础。

1 实验部分

1．1 仪器和试剂

Angilent7890A GC，0．22μm 针头过滤器，电子天平，98-1型磁力搅拌器。发酵法生产的透明质酸钠（HA，医用辅料级），二乙烯基砜（含量99%）;乙醇、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠均为分析纯。

1．2 DVS-HA凝胶的合成

将透明质酸钠 0．5g 溶解到 12．5mL 0．2mol·L－1NaOH溶液中获得4%（w／v）的溶液，室温搅拌1h，溶液均质透明。称取一定量DVS加水稀释至0．5mL，将其加入透明质酸碱溶液，迅速搅拌，室温下反应1h得粘稠状凝胶。反应式如下:

1．3 凝胶后处理

1．3．1 方案一

将凝胶在 80mL 磷酸盐缓冲溶液（0．01mol·L－1，p H 7．0）中溶胀 48h，过滤除去缓冲溶液，用 40mL水洗涤2次，再用80mL等渗磷酸盐缓冲溶液（0．01mol·L－1，pH7．0）浸泡至凝胶透明均质，过滤，水冲洗得透明质酸钠水凝胶。

1．3．2 方案二

将凝胶在 80mL 磷酸盐缓冲溶液（0．01mol·L－1，pH 7．0）中溶胀 24h，过滤除去缓冲溶液，用 40mL水洗涤2次，再用3倍体积95%乙醇洗涤凝胶变为絮状沉淀，过滤后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，除去残留乙醇，然后用80mL生理盐水浸泡至凝胶透明均质，过滤得透明质酸钠水凝胶。

1．3．3 方案三

将凝胶用 0．02mol·L－1盐酸溶液洗涤至中性，再用3倍体积95%乙醇洗涤，凝胶变为絮状沉淀，过滤，反复洗涤2~3次，取每次乙醇上清液，用0．22μm针头过滤器过滤，取滤液进行气相检测，DVS残留量合格后停止洗涤。过滤得白色絮状沉淀，除去残留乙醇，得交联透明质酸干粉。称取干粉质量按含量要求加入生理盐水浸泡至透明均质得透明质酸钠水凝胶。

1．3 气相检测

参照文献[5]方法进行气相色谱法检测。称取1g水凝胶，加入4mL乙醇，搅拌凝胶变为絮状沉淀，取上清液，用0．22μm针头过滤器过滤，取滤液装入试剂瓶自动进样进行检测。按外标法以峰面积计算样品中DVS残留量。

2 结果与讨论

由于交联剂DVS在水和乙醇中具有很强的溶解能力，所以溶胀步骤既可以使凝胶的pH稳定也可以去除残留的DVS。通过上述实验可以看出:方案一比较简单易行，但是需要长时间浸泡才能使凝胶中的DVS残留量达到要求;根据HA以及DVS-HA在乙醇中不溶解的性质，方案二与三用乙醇沉淀法很容易去除残留DVS，同时也需要去除乙醇，形成凝胶必须满足乙醇残留量要求（不大于 400μg·g－1），增加了检测步骤，与方案一相比，步骤相对繁琐一些;方案三与方案二比较，优点是形成干粉容易保存，同时也可以按含量要求进行浸泡。

通过多方案实验，初步筛选方案一作为DVSHA凝胶制备的较优工艺，但是HA临床应用产品的开发还需要兼顾考虑其他因素，如流动性和可注射性等。

[1] 杨好，熊文说，应国清，等．交联透明质酸衍生物的制备与应用进展[J]．化工进展，2006，25（12）:1410-1414．

[2] 陈景华，林枞，顾其胜，等．制备透明质酸衍生物交联剂的应用研究 [J]．中国修复重建外科杂志，2004，18（1）:70-73．

[3] 葛翠兰，顾其胜．交联透明质酸凝胶中交联剂的HPLC测定[J]．上海生物医学工程，2006， 27（4）:223-225．

[4] 陈拓成，陈丽夙．交联透明质酸的制造方法[P]．CN 101724164A，2010-06-09．

[5] 朱彬，葛翠兰，顾其胜．气相色谱法检测交联透明质酸中交联剂残留量 [J]．生物医学工程学进展，2008，29（1）:26-28．

Preparation Technology of Crosslinked Sodium Hyaluronate Gels

WANGYan-guo， FUJing-guo，PANGShi-yi
（Institute of Chemistry， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450002）

The HA-gels were prepared with bacterial fermentation of hyaluronic acid（HA）and divinyl sulfone（DVS）．To remove unreacted cross linking agent， many experiments were programmed．The content of DVSin gels was determined by gas chromatography．The HA-gels could be prepared under optimal reaction conditions，which established foundation to develop cosmetic HA products．

crosslinked sodium hyaluronate; divinyl sulphone; gas chromatography

TQ 464.1

A

1671-9905（2011）09-0008-02

王艳果（1981-），女，硕士，研究方向为有机合成，E-mail:hxswyg＠126．com

2011-05-26