蚯蚓金属硫蛋白定量PCR检测方法及其分子诊断

陈 春,周启星 (1.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津 300071；2.农业部环境保护科研监测所,天津 300191)

蚯蚓金属硫蛋白定量PCR检测方法及其分子诊断

陈 春1,2,周启星1*(1.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津 300071；2.农业部环境保护科研监测所,天津 300191)

根据GenBank中蚯蚓(Eisenia fetida)金属硫蛋白(MT)基因序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出目的基因片段,将目的基因片段插入pEASY-Blunt中制备质粒标准品.通过不同梯度稀释倍数的质粒标准品,建立了目的基因MT与内参基因β-actin的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法.通过土壤染毒培养实验,将蚯蚓分别暴露于50,500,1000mg/kg 重金属Cd染毒的自然土壤中培养14,28d,研究蚯蚓体内MT mRNA转录水平的表达变化.结果表明,重组质粒测序后显示目的片段序列同源性好,证明所设计的MT、β-actin引物能成功用于蚯蚓MT mRNA的检测.两基因构建的荧光定量标准曲线线性关系分别为0.994,0.999,且PCR扩增效率也皆接近于100%.染毒实验发现,Cd可诱导蚯蚓体内MT mRNA的表达,其表达水平与Cd污染暴露呈现出剂量-效应和时间-效应关系,表明蚯蚓MT基因可作为潜在分子标志物,诊断环境中Cd污染及其暴露水平.

金属硫蛋白；蚯蚓；荧光定量RT-PCR；镉；分子标志物

金属硫蛋白(MT)是一类普遍存在于生物体内的低分子量(6～7kDa)、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白,它能广泛地被重金属、电离辐射、化学药品、激素、应激激素等多种因素诱导表达合成[1-2].从生态系统角度来看,蚯蚓是陆生生物与土壤介质之间信息传递的桥梁,它具有直接与土壤或化学污染物暴露相接触的优越性[3].因此,蚯蚓通常作为陆地生态毒理学领域中的优先指示物种,用来指示土壤中重金属等有毒物质的污染状况[4].国外学者发现[5],某些重金属可诱导蚯蚓体内MT的特异性表达,推荐MT作为潜在的新型生物标志物,用来评价重金属对土壤生态系统的生物效应.而国内的相关研究还仅局限于使用传统方法检测MT的表达水平,如分光光度计法检测重金属胁迫下蚯蚓体内 MT粗蛋白含量[6].近年来,随着分子生物技术的发展,一些检测与评价环境的有效方法相继建立和发展起来.荧光定量RT-PCR技术作为一种核酸定量的手段,以其特异性强、灵敏度高、重现性好、全封闭反应等特点,被广泛用于环境分子生物标志物检测以及分子生态毒理学等诸多领域[7].

本实验使用 SYBR Green I荧光定量RT-PCR技术,建立了MT基因在转录水平上的检测方法,并结合土壤染毒模拟试验,研究蚯蚓MT基因表达水平在重金属Cd暴露胁迫下的变化规律,以期为今后应用MT作为分子生物标志物诊断环境中 Cd污染状况,提供方法基础和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

选择具有明显生殖环带(2～3个月龄)、体重为 400～450mg、已驯化的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为供试物种.供试污染物 CdCl2·2.5H2O为分析纯.

土壤采自天津塘沽森林公园,为 0～20cm表层洁净自然土壤.

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓MT基因的SYBR Green I定量PCR检测 Trizol法提取蚯蚓总RNA.总RNA经RQ1 RNase-Free DNase (Promega,美国)处理纯化后,取 1μg总 RNA,采用逆转录酶 ReverTra Ace (Toyobo,日本)合成DNA.根据GenBank发表的蚯蚓 MT序列(登录号 AJ236886)[8],设计扩增 MT基因片段的引物,其上游引物:5’-TGTGCTGACGCTGAGAAG-3’;下游引物:5’-TGATGACA GAGTTCCGTAT-3’.内参基因 β-actin引物设计参照 Brulle[9],上游引物:5’-CAAGCAGGAGTACGATG-3’;下游引物:5’-TCCGCAAGCTGAGCAT-3’,由上海生工合成.

取cDNA 2μL,上下游引物各1.5μL,10mmol/L dNTPs 1μL,25mmol/L MgSO43μL, KOD-plus-1μL,10×PCR Buffer 5μL,ddH2O35μL,反应总体积50μL.94℃预变性2min;98℃变性10s, 55℃退火30s,68℃延伸 30s,35个循环;68℃延伸 10min. PCR产物采用凝胶回收试剂盒(Axygen,美国)纯化后,连接至平末端载体pEASY-Blunt (全式金,北京),再转化至top10感受态细胞上,挑取重组成功的菌落进行PCR初步鉴定,将筛选出的阳性菌落进行培养,质粒提取试剂盒(Axygen,美国)抽提、纯化质粒.用DEPC处理后的ddH2O将重组的MT、β-actin质粒10倍系列稀释后,作为荧光定量标准品-20℃保存.同时任选3个重组质粒进行双酶切和测序分析(测序由北京华大基因公司完成).采用NCBI中Blast程序进行同源性比较.

荧光定量PCR扩增体系为20μL,其中SYBR Green I Master Mix(Bio-rad,美国) 10μL, ddH2O 6.4μL,上下游引物(10μmmol/L)各 0.8μL,模板质粒 DNA 2.0μL.反应条件是 95℃预变性 2min, 95℃变性15s,55℃退火30s,72℃延伸采集荧光信号30s,45个循环.定量PCR反应结束后熔解曲线分析:95℃ 1min;60℃ 1min,60℃ 30s后,0.5℃/s (温度每秒递升0.5℃),直至95℃结束.

分别制备 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝数/μL等梯度浓度的 MT和 β-actin标准质粒,然后进行定量PCR扩增,检测荧光定量PCR的灵敏度.此外,为了验证检测方法的重复性,重复制备 1×103、1×104、1×105、1×106、1×107拷贝数/μL标准品5次,荧光定量PCR扩增后分别得到Ct值,计算出每个浓度标准品的5次Ct值之间的变异系数. 1.2.2 重金属Cd诱导蚯蚓体内MT在转录水平的表达 经自然风干后的土壤样品过筛(粒径＜2mm),其土壤理化性质为:颗粒组成为 47.4%黏粒,38.4%粉粒,14.6%沙粒;有机质含量为4.2%;阳离子交换量是 20.35cmol/kg;pH7.2.鉴于农田土壤Cd背景值为0.15～8.23mg/kg[10]和蚯蚓的半致死浓度LC50[11],分别配制50,500,1000mg/kg的Cd浓度(以CdCl2·2.5H2O浓度计)溶液,与土壤(500g)混合均匀稳定7d后,调节土壤水分含量为最大持水量的60%.每个处理和对照分别加入10条蚯蚓,各重复4次.污染暴露14和28d后,采用相对定量方法分析蚯蚓体内MT mRNA的表达水平[12].数据处理使用 SPSS13.0软件单因素方差分析

(ANOVA),多重比较采用 Dunnett’s,与对照比较时P＜0.01为显著性差异.

2 结果与分析

2.1 蚯蚓MT基因荧光定量方法的建立与验证

2.1.1 提取的蚯蚓总RNA纯度和完整性 蚯蚓总RNA的A260/A280为1.92,表明Trizol法提取出的总 RNA纯度较高.此外,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明RNA条带完整,无降解(图1).

图1 蚯蚓总RNA电泳图谱Fig.1 Electrophoresis image of total RNA from earthworm

2.1.2 RT-PCR产物鉴定、克隆、测序 PCR扩增产物经电泳检测后,初步推测两基因片段大小皆为160bp左右(图略),但仍需通过克隆、酶切及测序等验证其是否为目标基因.挑取克隆单菌落进行PCR反应,1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示,克隆单菌落均含可能含有目的基因片段.然后各选取典型的3个克隆单菌落提取质粒.

MT、β-actin重组质粒经EcoR I、BstX I双酶切后,均分别获得与目的片段长度相近的条带(含有部分载体克隆位点序列)(图 3),表明所检测的单克隆菌落均为阳性,重组子都含有目的片段,且片段已连接至载体上.然后分别将3个MT、β-actin重组质粒进行测序.

图2 MT基因与β-actin基因菌落PCR电泳图Fig.2 Electrophoresis image of colony PCR product of MT and β-actin

图3 MT基因与β-actin基因质粒酶切电泳图Fig.3 The identification of restrictive enzymes digestion of plasmids MT and β-actin

经测序发现,3个MT基因重组质粒DNA片段相同.其序列通过NCBI数据库中Blast程序比对证实,与 GenBank中已收录的蚯蚓 MT序列(AJ236886)相似性为100%,表明本实验所设计的引物可成功扩增蚯蚓体内MT基因.3个β-actin重组质粒的测序结果皆相同,与GenBank中已有的蚯蚓 β-actin序列(DQ286722)比对基本一致,也表明设计的引物符合实验要求.

2.1.3 荧光定量PCR方法的灵敏度与重复性分析 选取1×102～1×109拷贝数/μL的MT重组质粒作为定量PCR模板,扩增曲线见图4a.同时,扩增产物熔解曲线显示目的产物具特异的单个峰(图5a),说明以上各稀释度的模板,定量PCR均可扩增出特异性产物.质粒浓度在 1×103～1×109拷贝数/μL范围内时,模板拷贝数的对数与相应的扩增反应Ct值呈线性关系,R2达到0.994,扩增效率E为100.5%,标准曲线回归方程为y=-3.311x+ 38.565,其中y为Ct值,x为MT基因质粒的拷贝数对数(图 6a).当质粒最低浓度为 1×102拷贝数/μL时,反应也可扩增出特异性目的条带,但对应Ct值与其他高浓度时的Ct值间的线性关系稍差.

图4 MT基因、β-actin基因荧光定量PCR扩增动力学曲线Fig.4 The kinetic curve of real-time quantitative PCR amplification of MT and β-actin

内参基因 β-actin定量 PCR扩增曲线如图4b,熔解曲线见图 5b.结果表明,β-actin质粒浓度为1×102～1×109拷贝数/μL时,均可扩增出特异性目的产物.且质粒浓度为1×103～1×108拷贝数/μL范围内时,模板拷贝数的对数与相应的Ct值呈线性关系,R2高达0.999,扩增效率为99.4%,标准曲线回归方程为y = -3.337x+ 37.667(图6b).

5组标准品平行(浓度为1×103～1×107拷贝数/μL)荧光定量PCR结果如表1,其重复样品间的变异系数分别为1.13%、1.81%、1.51%、1.24%、 2.01%.表明 5组标准品间检测方法的重现性好,试验结果是稳定可靠的.

图5 MT基因、β-actin基因的熔解曲线分析Fig.5 The melt curve analysis of MT and β-actin

2.2 重金属Cd对蚯蚓MT转录水平表达的影响

由图7可知,空白对照组中蚯蚓体内MT基因表达水平几乎没有变化.与对照组比较,暴露于不同浓度Cd中蚯蚓体内MT mRNA的表达水平极显著性上调(P＜0.01).且随着 Cd浓度的增加,蚯蚓MT mRNA的表达水平也随之升高.即Cd染毒暴露 14d时,50和500mg/kg Cd处理组的MT mRNA表达水平分别是对照组的12.6倍和14.8倍,1000mg/kg Cd处理组的MT mRNA表达水平较对照组高达26.8倍.结果还显示,随着Cd暴露时间的延长,同一浓度组的MT mRNA表达水平也随之升高.即50,500mg/kg Cd染毒28d后,与14d处理组相比较MT mRNA表达水平皆有升高,且分别是对照组的16.1倍和20.0倍.另外与其他浓度处理组相比较,1000mg/kg Cd暴露28d的处理组MT mRNA诱导水平最高,是对照组的36.8倍.

图6 MT基因、β-actin基因的标准曲线Fig.6 The standard curve of MT and β-actin

表1 MT基因标准品Ct值检测的重复性验证Table 1 Reproducibility evaluation on the Ct value of MT plasmid standards

3 讨论

MT普遍存在于各种生物体中[13-14],尤其以肝脏和肾脏中含量最为丰富,它能广泛地被重金属、激素、以及其他环境因素诱导表达合成.土壤生态毒理学领域中,蚯蚓通常作为主要的指示物种,用来评价环境污染物的暴露水平.其中,Cd等重金属可诱导蚯蚓体内MT基因的表达.因此,国外逐渐开展蚯蚓MT mRNA作为重金属污染暴露下分子生物标志物的研究[9,15-16],但国内研究尚属空白.考虑到蚯蚓品种因地域性差异引起的其MT基因略有差别.本研究选用国内蚯蚓品种赤子爱胜蚓作为供试物种,通过成功克隆 MT cDNA片段,建立蚯蚓MT基因的SYBR Green_I定量PCR检测方法,并且分析了Cd暴露胁迫下MT基因转录水平的变化趋势,从而探讨 MT基因作为分子标志物表征Cd暴露水平的可行性.

图7 重金属Cd对蚯蚓体内MT mRNA转录水平的影响Fig.7 Expression level of MT mRNA in earthworm exposed to Cd*表示同一暴露时间下处理组与对照比较差异极显著(P＜0.01)

通过优化PCR反应体系、反应条件和筛选合适的引物等实验前期工作,目的基因MT与内参基因 β-actin的标准曲线线性关系分别为0.994、0.999,PCR扩增效率皆接近100%,荧光定量标准曲线均被成功构建.通常,试验样本 RNA或cDNA浓度不同、样本的保存与采取、RNA提取、反转录等过程均会导致mRNA拷贝数出现误差.而通过管家基因β-actin作为内参标准化MT基因mRNA拷贝数,可以减少实验误差.本文成功构建了蚯蚓MT基因质粒,其质粒DNA可作为MT基因绝对定量标准品使用,从而为检测蚯蚓体内MT基因的表达水平奠定了基础.而且目的MT与管家基因β-actin的扩增效率均接近于100%,且二者扩增效率之差远小于 10%.故研究外界因素诱导蚯蚓 MT表达水平的时空变化水平时,可采用相对定量分析方法中的比较Ct法分析试验数据.本研究建立的蚯蚓 MT基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法最低检出限为1×102拷贝数/μL,且在其质粒浓度为 1×103～1×109拷贝数/μL范围内具有良好检测效果,检测器幅度高达7个数量级,实验重现性好.

此外,土壤实验表明Cd污染胁迫下,蚯蚓MT mRNA的表达水平呈现出剂量-效应和时间-效应关系.这说明蚯蚓MT基因可能作为潜在的分子标志物用来表征、评价土壤中Cd的污染暴露水平,这与多数国外学者的研究结果相一致. Brulle等[9]指出暴露于80,800mg/kg Cd污染的人工土壤中,蚯蚓 MT基因表达水平显著升高. Svendsen等[14]的研究也发现,暴露于重金属污染的蚯蚓 MT-2基因表达水平和蚯蚓个体繁殖数目存在很好的线性关系,并强调MT-2转录水平的表达作为生物标志物可很好的监控Cd为代表的重金属污染水平.

本实验建立了蚯蚓 MT基因的荧光定量RT-PCR检测方法,并且开展了重金属Cd胁迫下蚯蚓MT mRNA表达水平的研究.检测方法的建立可为蚯蚓 MT基因转录水平的定量检测与差异性的相对分析提供了有效的技术手段.本研究也为 MT基因作为潜在分子标志物指示环境中Cd的污染暴露水平提供了方法基础和参考依据.今后,关于重金属微量持续污染对蚯蚓 MT mRNA的表达有何影响,尚有待于进一步的研究.

4 结语

经测序与序列同源性分析表明,目的基因与已发表的蚯蚓 E. fetida相应的功能基因序列同源性极高,达到预期克隆目的基因的要求.建立了MT、β-actin基因的荧光定量标准曲线,其线性关系均高于0.99, PCR扩增效率均接近于100%.Cd土壤染毒暴露下,蚯蚓体内MT mRNA诱导表达水平与Cd浓度间存在剂量-效应和时间-效应关系,其中 1000mg/kg Cd暴露 28d的处理组MT mRNA上调表达水平最高,是对照组的36.8倍.

[1] Kägi J H R. Overview of metallothionein [J]. Methods Enzymol., 1991,205:613-626.

[2] 陈 春,周启星. 金属硫蛋白作为重金属污染生物标志物的研究进展 [J]. 农业环境科学学报, 2009,28(3):425-432.

[3] 徐冬梅,许晓路,刘文丽,等.异丙甲草胺及其 S型对映体对蚯蚓的急性毒性差异 [J]. 中国环境科学, 2009,29(9):1000-1004.

[4] 周启星,孔繁翔,朱 琳.生态毒理学 [M]. 北京:科学出版社, 2004.

[5] Dallinger R, Berger B, Gruber C, et al. Metallothioneins in terrestrial invertebrates: structural aspects, biological significance and implicateo-ns for their use as biomarkers [J]. Cell Mol. Biol., 2000,46:331-346.

[6] 陈 京.不同诱导方法对赤子爱胜蚓中的金属硫蛋白的影响[J]. 中国医学导报, 2009,3:20-21.

[7] 周启星,王美娥.土壤生态毒理学研究进展与展望 [J]. 生态毒理学报, 2006,1(1): 1-11

[8] Gruber C,Stürzenbaum S,Gehrig P, et al. Isolation and characterize-ation of a self-sufficient one-domain protein (Cd)-Metallothionein from Eisenia fetida [J]. Eur. J. Biochem., 2000,267:573-582.

[9] Brulle F, Mitta G, Cocquerelle C, et al. Cloning and real-time PCR testing of 14 potential biomarkers in Eisenia fetida following cadmium exposure [J]. Environ. Sci. Technol., 2006, 40:2844-2850.

[10] 王 芸,张建辉,赵小军.污灌农田土壤镉污染状况及分布特征研究 [J]. 中国环境监测, 2007, 23(5):71-74.

[11] 宋玉芳,周启星,许华夏,等.土壤重金属污染对蚯蚓的急性毒性效应的研究 [J]. 应用生态学报, 2002,13(2):187-190.

[12] Quirósa L, Piñaa B, Soléb M, et al. Environmental monitoring by gene expression biomarkers in Barbus graellsii: Laboratory and field studies [J]. Chemosphere, 2007,67(6):1144-1154.

[13] Margoshes M, Vallee B L. A cadmium protein from equine kidney cortex [J]. J. Am. Chem. Soc., 1957,79:4813-4814.

[14] Cobbett C, Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis [J]. Annual Review of Plant Biology, 2002,3:159-182.

[15] Svendsen C, Hankard P K, Lister L J, et al. Effect of temperature and season on reproduction, neutral red retention and metallothionein responses of earthworms exposed to metals in field soils [J]. Environmental Pollution, 2007,147:83-93.

[16] Homa J, Olchawa E, Stürzenbaum S R, et al. Early-phase immuned-etection of metallothionein and heat shock proteins in extruded earthw-orm coelomocytes after dermal exposure to metal ions [J]. Environmental Pollution, 2005,135:275-280.

Quantitative real time PCR method for detection of metallothionein in Eisenia fetida and application of molecular diagnosis in cadmium exposure.

CHEN Chun1,2, ZHOU Qi-xing1*(1.Key Laboratory of Environmental Pollution Process and Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2.Agro-Environmental Protection Institute of Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China). China Environmental Science, 2011,31(8)：1377～1382

The primers were designed based on previous reported sequence of metallothionein (MT) gene. Selected genes were amplified by RT-PCR and cloned into pEASY-Blunt vector to construct recombinant plasmid. Standard curves of target gene (MT) or reference gene (β-actin) were generated using serial dilution of recombinant plasmids cDNA. And the method of SYBR Green I real-time quantitative PCR was established for the detection of MT mRNA transcript level. Moreover, MT gene expression level was detected in Eisenia fetida after 14 and 28d of exposure to 50,500,1000mg/kg Cd. The results of sequence alignment showed that the sequences of cDNA fragments in recombinant plasmid were confirmed to be correct corresponding to previous known genes, which indicated that MT and β-actin cDNA fragments were cloned respectively. The liner correlation coefficient of two standard curves was 0.994 and 0.999, respectively and PCR amplification efficiencies were both close to 100%. Therefore, the real-time PCR detection of MT gene expression was sensitive, specific and reliable. Furthermore, the expression level of MT gene was significantly (P＜0.01) up-regulated in a dose-dependent and time-dependent manner. The highest (36.8-fold) up-regulation level was found in E. fetida after 28d of exposed to 1000mg/kg Cd compared to controls. These results suggested that MT may be applied as a molecular biomarker provide early warning signs for the stress of Cd exposue in future.

metallothionein；earthworm；quantitative real-time PCR；cadmium；molecular biomarker

X17

A

1000-6923(2011)08-1377-06

2011-01-26

国家自然科学基金资助项目(21037002);国家环保公益性项目(201009032)

* 责任作者, 教授, zhouqx@nankai.edu.cn

陈 春(1980-),男,安徽宿县人,博士研究生,主要从事分子生态毒理学研究.发表论文10余篇.