PI3K／Akt通路在高糖诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原中的作用

邢玲玲 段惠军 刘青娟 傅淑霞 刘淑霞 郝 军

PI3K／Akt通路在高糖诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原中的作用

邢玲玲1，2段惠军1＊刘青娟1傅淑霞2刘淑霞1郝 军1

（1河北医科大学病理教研室，石家庄050017；2河北医科大学第二医院肾内科，石家庄050000）

目的 探讨磷酸酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）信号通路在高糖诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原（ColⅣ）中的作用。方法 体外培养小鼠肾足细胞，给予高糖刺激（30mmol／L）处理0h、12h、24h、48h，正常糖（5mmol／L）分别培养相同时间作为对照，采用免疫细胞化学染色法和蛋白印迹法检测p-Akt、ColⅣ的表达。结果 高糖可以诱导足细胞内p-Akt蛋白表达，随刺激时间延长分泌增多，24h达到高峰，各时间点相比有统计学差异（P＜0.05）；足细胞内ColⅣ蛋白表达随高糖刺激时间延长逐渐增多，并与p-Akt表达呈正相关关系（r＝0.834，P＝0.001）。结论 高糖可能通过激活PI3K／Akt通路诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原。

PI3K／Akt通路；足细胞；Ⅳ型胶原

随着人民生活水平的提高和人口老龄化的不断加速，糖尿病肾病 （diabetic nephropathy，DN）发病率逐年提高，其发病机制至今仍未阐明。肾小球的三种固有细胞均与DN的发生有着密切关系，但最近研究认为足细胞损伤是导致肾小球硬化的关键因素［1］。随着生化技术的发展及足细胞系的建立，对足细胞的研究和认识也逐渐深入。体外培养小鼠足细胞发现，高糖刺激足细胞分泌Ⅳ型胶原（collogenⅣ，ColⅣ）、血管内皮生长因子等表达，导致基底膜变厚，表明足细胞损伤参与了糖尿病肾小球硬化发生［2］。

磷酸酰肌醇3激酶／蛋白激酶 B（phosphoinositide 3kinese／protein kinase B，PI3K／Akt）信号通路参与细胞分化、增殖、凋亡以及迁移等，其过度激活导致细胞功能失调。新近研究表明，PI3K／Akt信号通路参与高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，提示该通路在肾小管上皮细胞损伤中的作用［3］。该途径在糖尿病肾病足细胞损伤方面的研究未见报道。本课题拟通过体外培养小鼠足细胞，观察PI3K／Akt通路以及Ⅳ型胶原在足细胞内的表达变化，探讨PI3K／Akt通路在高糖诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原中的作用。

材料和方法

1.材料

小鼠肾足细胞株从中国协和医科大学细胞中心购买。兔抗p-Akt多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗ColⅣ多克隆抗体购自北京博奥森公司，SABC步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。

2.方法

2.1 建立高糖诱导的足细胞模型

小鼠足细胞按 Mundel等［4］方法进行培养：将冻存的足细胞复苏后置于含10U／mlγ-干扰素的10%胎牛血清的DMEM-F12培养液中，在33℃细胞培养孵箱中培养传代，然后转入不含γ-干扰素的10%胎牛血清的DMEM-F12培养液中，37℃培养孵箱中使足细胞分化10-14d后，给予高糖（high glucose，HG，30mmol／L）刺激，分别培养0、12、24、48h，同时以正常糖（normal glucose，NG，5mmol／L）培养相同时间作为对照，收集不同时间点足细胞。

2.2 免疫细胞化学检测

采用6孔板，置无菌盖玻片爬片，每组6孔细胞，70%乙醇固定细胞30min；3%H2O2甲醇室温孵育10min；羊血清封闭37℃孵育30min；一抗（兔抗p-Akt抗体1∶100稀释，兔抗ColⅣ抗体1∶50稀释）4℃过夜，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照；二抗37℃孵育30min；三抗37℃孵育25min；以上每步之间应用PBS缓冲液冲洗，5min，3次；DAB显色。光镜下观察足细胞内p-AKT、ColⅣ的表达。

2.3 Western blot分析

在不同时间点收集的细胞中，加入300μl蛋白裂解液裂解细胞，低温离心机离心，12000rpm，20min后提取蛋白上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，-80℃保存。每个样品取50μg总蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉37℃封闭2h，再分别加入抗p-Akt抗体（1∶1000稀释）和抗ColⅣ抗体（1∶500稀释），4℃过夜。ECL化学发光法显色。以β-actin（1∶1000稀释）作为内参照。Western blot条带信号强度应用LabWork 45图像分析软件进行定量分析，测定各条带的吸光度值（IOD）。以上实验过程重复3次。

2.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包分析，实验数值用表示，多组之间比较采用方差分析进行显著性检验，相关分析采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.免疫细胞化学检测p-Akt、ColⅣ的表达

正常糖组足细胞内未检测到p-Akt表达，高糖组足细胞细胞核内和胞浆中均有P-Akt表达，24h明显（图1A和1B）。ColⅣ在正常糖组未检测到表达，高糖组主要表达在足细胞胞浆中，时间上与PAkt表达一致，24h表达最明显（图2A和2B）。

2.Western blot检测足细胞内p-Akt、ColⅣ蛋白水平

Western blot检测p-Akt、ColⅣ的表达与免疫细胞化学检测结果基本一致（图3）。通过图像分析软件进行定量分析发现，高糖刺激足细胞12h后，p-Akt表达增多，24h达到高峰，48h后逐渐下降，各时间点相比均有统计学差异（P＜0.001）。ColⅣ表达随高糖刺激时间延长表达增多，24h最高，各时间点比较也均有统计学差异（P＜0.01）（表1）。足细胞内p-Akt与ColⅣ表达具有明显的正相关关系（r＝0.834，P＝0.001）。

表1 定量分析足细胞内p-Akt、ColⅣ蛋白的水平（¯x±s，n＝3）Table 1 The quantitative analysis of the level of p-Akt，ColⅣprotein in podocytes （¯x±s，n＝3）

图1 免疫细胞化学染色观察足细胞内p-Akt的表达 （×400）A：正常糖刺激足细胞24hB：高糖刺激足细胞24h图2 免疫细胞化学染色观察足细胞内ColⅣ的表达 （×400）A：正常糖刺激足细胞24hB：高糖刺激足细胞24hFig.1 Immunocytochemistry staining for observating the expression of p-Akt in podocytes（×400）A：podocytes treated by nomal glucose for 24h；B：podocytes treated by high glucose for 24hFig.2 Immunocytochemistry staining for observating the expression of ColⅣin podocytes（×400）A：podocytes treated by nomal glucose for 24h；B：podocytes treated by high glucose for 24h

图3 Western blot检测正常糖和高糖刺激足细胞后不同时间p-Akt、ColⅣ蛋白的表达。A：正常糖组；B：高糖组Fig.3 Western blot analysis of the expression of p-Akt，ColⅣin podocytes cultured by nomal glucose and high glucose for different time.A：NG group；B：HG group

讨 论

DN是糖尿病的主要并发症之一，也是导致慢性肾衰竭的重要原因，临床上以持续性蛋白尿和进行性肾功能减退为特征，基本病理改变是基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚、细胞外基质积聚和结节性肾小球硬化。其中细胞外基质积聚是DN的关键性改变。近年来国内外学者研究认为足细胞损伤在DN的发展中具有重要作用，但是足细胞损伤机制尚不清楚。研究表明，高糖环境、血液动力学改变、血管紧张素Ⅱ、细胞因子如转化生长因子-β1等均可导致足细胞分泌Ⅳ型胶原增多，促进GBM增厚［5-6］。本实验结果提示，高糖刺激可引起足细胞分泌Ⅳ型胶原，与国外Ha和Hong的报道一致［7］；随刺激时间延长，足细胞内Ⅳ型胶原表达增多，高峰在24小时，48小时后表达开始减弱，这种表达的时间规律性与Akt的激活一致。

PI3K／Akt通路的发现已有十几年的历史，其激活是一个多步骤的过程：受体酪氨酸激酶与其配体结合发生磷酸化后激活PI3K，PI3K活化后磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇三磷酸 （phosphatidylinositol 3，4，5 2trisphosphate，PIP3），PIP3和Akt N端的PH结构域结合，使Akt从细胞质转移到细胞膜上进一步被磷酸化，并作用于一系列底物，发挥其生物学作用。本实验通过体外细胞培养发现，高糖可刺激足细胞内Akt的激活，使p-Akt表达随时间延长而增多，且与Ⅳ型胶原的分泌高峰一致，二者表达具有正相关关系，提示高糖可能通过PI3K／Akt通路增强了足细胞分泌Ⅳ型胶原。Li等［8］也在系膜细胞上发现，高糖引起系膜细胞内Ⅳ型胶原的表达是通过激活Akt和转化生长因子-β实现的。

本研究通过体外培养小鼠足细胞发现，高糖可以诱导足细胞内p-Akt的表达，伴有Ⅳ型胶原的分泌增多，二者表达具有一定的相关性，提示高糖可能通过激活PI3K／Akt信号通路，上调足细胞内Ⅳ型胶原的表达，导致GBM增厚，进一步提示PI3K／Akt信号通路可能介导了足细胞损伤，参与了糖尿病肾病的发展。足细胞损伤的机制是多因素、多途径的共同作用，是各种致病因子间相互作用的结果，并非单一因素或单一途径发挥作用。这些致病因子间的相互作用以及信号途径间的网络机制还需进一步深入的研究。随着体外足细胞研究的发展，PI3K／Akt信号通路为了解足细胞损伤的机制及防治手段提供了一条新的途径。

［1］Petermann A，Floege J.Podocyte damage resulting in podocyturia：A potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.Nephron Clin Pract，2007，106（2）：61-66

［2］Cruz MC，Ziyadeh FN，Isono M，et al.Effects of high glucose and TGF-βon the expression of collagen Ⅳ and vascular endothelial growth factor in mouse podocyte.Kidney Int，2002，62（3）：901-913

［3］Rane MJ，Song Y，Jin S，et al.Interplay between Akt and p38MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（1）：F49-61

［4］Mundel P，Reiser J，Zuniga A，et al.Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.Exp Cell Ras，1997，236（1）：248-258

［5］Li JJ，Kwak SJ，Jung DS，et al.Podocyte biology in diabetic nephropathy.Kidney Int Suppl，2007，106 （8）：S36-42

［6］Phillips LM，Wang Y，Dai T，et al.The Renin Inhibitor Aliskiren Attenuates High-Glucose Induced Extracellular Matrix Synthesis and Prevents Apoptosis in Cultured Podocytes.Nephron Exp Nephrol，2011，118（3）：e49-e59

［7］Ha TS，Hong EJ，Ahn EM，et al.Regulation of type IV collagen alpha chains of glomerular epithelial cells in diabetic conditions.J Korean Med Sci，2009，24 （5）：837-843

［8］Li J，Lee YS，Choi JS，et al.Roasted licorice extracts dampen high glucose-induced mesangial hyperplasia and matrix deposition through blocking Akt activation and TGF-beta signaling.Phytomedicine，2010，17 （10）：800-810

Effect of PI3K／Akt pathway on the expression of collagenⅣin mouse podocytes induced by High Glucose

Xing Lingling1，2，Duan Huijun1＊，Liu Qingjuan1，Fu Shuxia2，Liu Shuxia1，Hao Jun1
（1Department of Pathology，Hebei Medical University，Shijiazhuang050017；2Department of Nephrology，the Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050000，China）

Objective To investigate the effect of the phosphoinositide 3kinese／protein kinase B（PI3K／Akt）pathway on the expression of collagen Ⅳ（ColⅣ）in mouse podocytes induced by high glucose.Methods Cultured mouse podocytes were divided into the high glucose（30mmol／L，HG）group and the normal glucose（5mmol／L，NG）group.Cells were collected respectively at 0，12，24，48hafter stimulation.The expression of phospho-Akt and collogenⅣ were detected by immunocytochemistry and Western blot.Results Compared with that of the NG group，the expression level of phospho-Akt was increased in a time-dependent manner，and reached the peak at 24h.The expression level of ColⅣin mouse podocytes was increased gradually with prolongation of stimulus.There was an obvious positive correlation between the level of ColⅣand that of phospho-Akt（r＝0.834，P＝0.001）.Conclusion High glucose may induce the expression of ColⅣin mouse podocytes by activating the PI3K／Akt pathway.

PI3K／Akt pathway；Podocyte；CollagenⅣ

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.004

2011-05-25

2011-09-20

河北省卫生厅医学科学研究重点课题（20090055）

邢玲玲，女（1978年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）