细菌生物膜感染的研究进展

施德仕综述，邵海枫审校

综述

细菌生物膜感染的研究进展

施德仕综述，邵海枫审校

生物膜是附着在有生命或无生命物体表面的由细菌自身产生的多聚基质包裹的菌细胞结构群体，医学上估计超过80%人类感染性疾病是由生物膜介导。文中就当前细菌生物膜研究发展的特点、生物膜形成机制和影响因素的一些的认识以及在细菌生物膜防治方面取得的进展作一综述。

细菌生物膜;抗药性;感染

0 引 言

经典细菌学的研究对象主要是游离细菌，而事实上，在自然界以及人和动物体内，细菌常常趋向于吸附在固体表面形成群落，成为黏滑的膜，即生物膜，它是细菌一种具有保护性的生长模式。目前对生物膜的定义是:附着在有生命或无生命物体表面的被细菌自身产生的多聚基质包裹的菌细胞结构群体，医学上估计超过80%人类感染性疾病是由生物膜介导的［1－2］。生物膜的研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科。90年代后，细菌生物膜研究越来越受到人们的重视，随着相关学科的发展及研究技术的进步，对细菌生物膜认识越发透彻，研究更加深入。

1 当前细菌生物膜研究发展的特点

1.1 对以往的抗菌及治疗生物膜感染方法提出质疑 在预防治疗生物膜感染方面，为了减少应用生物材料带来的感染，人们使用了许多办法，常见的方法是在生物材料外表包被一些抗菌或杀菌的物质。但是，一项模拟膀胱导尿管的实验却发现在硅树脂导尿管、硅树脂包被的胶乳导尿管、水凝胶包被的胶乳导尿管、水凝胶与银混合包被的胶乳导尿管以及硝呋醛(呋喃西林)硅树脂导尿管的表面迅速包被一层磷酸钙层(由变异链球菌等产脲酶细菌在碱性尿环境下产生)，从而隔绝抗菌或杀菌物质，随后高密度的结晶状的变异链球菌生物膜形成［3］。医学领域的研究显示Metafasix technology——用水溶性水凝胶聚合物包被牙科用橡胶圈，在潮湿环境下可以形成一个高度光滑的表面，可以显著减少细菌黏附。一种基于这种技术的产品——超滑橡胶圈生产出来希望能够有效控制细菌的定植。然而最近一项体内实验的结果却让人大失所望:超滑橡胶圈上检测出的变异链球菌不仅没有减少，甚至大大多于传统橡胶圈［4］。又有研究表明，在骨水泥中加入大剂量的硫酸庆大霉素并不能预防细菌定植和生物膜形成，反而影响了义肢的性能和使用寿命［5］。临床上，乙醇广泛用于皮肤消毒及导管的保存液，但是乙醇却能诱导表皮葡萄球菌生物膜的产生［6］。

1.2 对以往的一些观点有了进一步的认识

1.2.1 对于具体的某些细菌生物膜形成机制的研究进一步深入 以表皮葡萄球菌为例，其致病性与其形成生物膜的能力密切相关，多数菌株依赖多糖细胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)来调整生物膜的形成。PIA是由ica操纵子编码的酶控制合成的，表皮葡萄球菌的ica操纵子在乙醇、药物等条件存在下表达提高［6］。而ica操纵子正是生物膜形成的关键物质细胞间PIA的编码基因，起到调节细菌间黏附及多层次的生物膜聚集的作用。插入序列IS256到ica操作子可使其丧失形成生物膜的能力。但是现在发现在插入序列IS256仍存在的情况下，生物膜形成能力却得到恢复，形成一种不依赖PIA的蛋白质生物膜［7］。

1.2.2 一些细菌生物膜感染的相关错误观点得以纠正 很多刊物都称非典型流感嗜血杆菌能形成特殊的生物膜，并用此来解释不能用中耳炎渗出物培养出非典型流感嗜血杆菌，以及非典型流感嗜血杆菌的耐药性和致病性，预防和治疗方案也是以生物膜为前提［8］。然而Moxon等［9］称实际上非典型流感嗜血杆菌并没有不断演变的特异的生物膜表型，没有生物膜必须成分表多糖，不具备生物膜特殊的代谢特点，之前假设的“生物膜”仅是由一些细菌及宿主成分组成，包括细菌膜组份(脂多糖和蛋白，凋亡或坏死细胞的DNA降解产物)以及宿主炎症和免疫应答产物。一般认为羊膜腔感染是由游离细菌所致，事实并不尽然，羊膜腔内细菌生物膜感染已有报道［10］。由于临床上体内留置装置的使用不断增加，凝固酶阴性葡萄球菌生物膜感染已经很普遍。其中路邓葡萄球菌就是一种具有致病性的凝固酶阴性葡萄球菌，具有和其他凝固酶阴性葡萄球菌独一无二的特点，具有类似于金黄色葡萄球菌的极强的侵袭性和破坏性，及部分分离菌株能够产生一种联合细胞膜形式的“凝固酶”，这些特点以往常使实验室错误的将路邓葡萄球菌鉴定为金黄色葡萄球菌［11］。

1.3 进一步认识控制细菌生物膜感染重要性 随着医疗技术水平的进步，越来越多的生物膜感染被发现，许多难以抗菌治疗的感染都可以溯源到生物膜之上。在鼓膜造孔术后患者常形成难治性耳漏，环丙沙星等药物治疗均无效，通过扫描电镜观测使用过的鼓膜造孔插管，Jang等［12］发现在大多数插管表面几乎没有空隙的布满浓厚的铜绿假单胞菌生物膜，这正是引起难治耳漏的主要致病菌。牙髓持续性感染不是由于高度顽固的细菌，而是在于它们在生理和基因上发生改变形成生物膜而适应了治疗形成的新环境［13］。金黄色葡萄球菌形成生物膜而产生很强耐药性，研究发现多重耐药性菌株形成生物膜的比率明显高于较少耐药性菌株［14］。形成生物膜致耐药的表皮葡萄球菌的院内感染很难治愈。流行病学调查及基因分析发现医院内分离的表皮葡萄球菌和在医疗器材上分离的表皮葡萄球菌在生物膜形成、耐药性、可移动DNA成分方面均有所不同，有着强大的向其他院内感染菌传递耐药性的能力［15］。

1.4 细菌生物膜研究的复杂性 细菌生物膜研究往往不能局限于对单一细菌的研究，有时会遇见细菌与其他细菌和(或)真菌联合形成生物膜，由于微生物群之间相互作用，而具有与各自单独感染所不同的特点，其独特的复杂的生物膜结构组成使生物膜更具耐药性，更加难以控制［16］。Baena-Monroy等［17］在做假牙所致口腔炎检查时，发现50例口腔炎患者中39例存在白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌共同感染。白假丝酵母菌和铜绿假单胞菌是呼吸机相关肺炎最常见的致病菌，由于形成生物膜而导致感染持续和复发［18］。具有相同电荷的粪肠球菌菌株只有在带有与之相比较少电荷的某些微生物的存在的条件下形成一个具有异种电荷的微生物菌群，然后才形成生物膜［19］。

细菌适应环境的能力不同以及生物膜可以在宿主多部位形成使得生物膜的研究错综复杂，但是，研究者们正是从这些复杂的表象中总结出规律来。多数生物膜感染发生在宿主上皮组织，这个特征也是鉴别生物膜感染和细菌定植的首要标准。致病菌或机会致病菌引起的慢性感染常与生物膜形成相关，常见的如:铜绿假单胞菌诱发的囊性纤维化性肺炎、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌导致的慢性中耳炎、金黄色葡萄球菌引起的慢性鼻窦炎以及大肠埃希菌相关的泌尿道重复感染等［8］。由于生物膜系统对药物和宿主免疫力的耐受，这类感染常常难以治愈［8，20］。

1.5 研究生物膜的方法及技术的进步 细菌生物膜研究的深入得益于生物膜研究方法及技术的进步，为此我们应该关注一下生物膜研究方法及技术的进展。人们为培养和定量分析细菌生物膜而建立很多方法，如试管法、微量滴定板法、放射性标记术、显微镜术、刚果红琼脂平板法。目前，最常用的体外细菌生物膜培养和定量检测的方法是微量滴定板法，但是对不同细菌形成的生物膜的统一规范的分析方法尚无定论［21］。微量滴定板法是经试管法改良而来，简单易行，敏感度高，具有批处理的优势，能够加快大批样品的操作速度同时还能保持试验一致性。其原理是利用结晶紫可与细菌生物膜紧密结合不被脱色液洗脱的特征，比色法检测结合在生物膜上的结晶紫的吸光度的大小间接地对细菌生物膜进行定量［22］。刚果红琼脂平板法是利用刚果红染料可与生物膜重要组份表多糖结合的原理将刚果红加入特定的培养基中，通过培养生物膜阳性的菌株形成黑色菌落而阴性菌株菌落呈红色，该法具有简单易行，结果易于观察，适合临床实验室常规应用的优点［23］。

与此同时，前沿的方法和技术也陆续应用于细菌生物膜的检测。细菌聚集是细菌生物膜的重要表现之一，用荧光染色技术检测细菌聚集现象，与传统检测方法相比敏感性高，检出率高，是一种高度敏感的检测细菌聚集现象的方法［24］。Parry等［25］认为高频超声扫描摄像技术原位检测生物膜的三维结构快速、简便、准确且对生物膜结构没有损害，可用于监测生物膜在不同时期的功能变化。Mastronardi和Ramirez-Arcos［26］以divIVA和icaA作为目标基因，用定量PCR技术检测血小板制剂中致病性表皮葡萄球菌形成的生物膜，指出定量PCR技术是一种高度敏感的检测生物膜细菌的方法，可以用来检测血液传播性致病菌。

2 细菌生物膜形成的影响因素

2.1 影响生物膜形成的细菌自身因素 生物膜形成不是由单个因子单独决定的，生物膜形成是多因子共同作用的结果。首先就细菌本身而言能形成生物膜的菌株与不能形成生物膜的菌株相比有着自身特有的特点。例如，大肠杆菌形成牢固生物膜的菌株与形成薄弱生物膜菌株在毒力基因上是有所不同的:前者的表面毒力相关基因较常见，表达表面毒力因子的频率更高［27］。而金黄色葡萄球菌去除与脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)成分糖脂合成有关的ypfP基因后，突变菌株将减少87%的LTA成分，疏水性较普通菌株大大提高，而完全丧失了在塑料上形成生物膜的能力［28］。在A群链球菌中，菌毛在生物膜形成中的黏附定植过程中有着重要作用，去除编码菌毛骨架结构蛋白基因后无法产生菌毛的A群链球菌则失去了黏附细胞的能力，不能形成生物膜，如果这样的菌株重新获得去除的菌毛相关基因后又具备了形成生物膜的能力［29］。

其次，生物膜内细菌协调机制在生物膜形成和稳定过程中都起着重要作用。生物膜内细菌密度高，营养相对匮乏，废物较难排出，细菌是怎样解决这些问题的?Cho等［30］发现在生物膜内细菌存在着一种“菌落组织”的行为，细菌之间有着高度调节作用，能够为细菌定向，形成共同的运动生长方式，能够有效的促进细菌游离出生物膜，同时还能够促进营养物质进入生物膜内。双组份系统(two-component system，TCS)是很多微生物重要的信号传导方式，通过调整基因表达，使微生物能够适应环境变化，如营养缺乏、渗透冲击、pH变化以及与其他致病菌的相互作用等［29］。正是在多重TCS的调节作用下生物膜内变异链球菌存活和持续存在［31］。

2.2 影响生物膜形成的细菌生存环境因素 生物膜的形成需要特定的环境因素。宿主生理病理的改变常影响细菌生物膜的形成。在宿主免疫系统释放的炎性因子作用下细菌生物膜生长更加迅速，McLaughlin和Hoogewerf［32］报道白介素1治疗金黄色葡萄球菌感染6h后形成生物膜的金黄色葡萄球菌株量增加至治疗前的2.5倍，而游离状态的金黄色葡萄球菌数目不变。Moreau-Marquis等［33］报道囊性纤维化肺本身的很多因素能够促进铜绿假单胞菌生物膜形成，其形成的黏液层为铜绿假单胞菌生长提供了厌氧或微需氧的环境，同时宿主分泌物中杀菌组份减少，呼吸道细胞的分泌物以及促进细菌定植和(或)生物膜结构形成的DNA和肌动蛋白量增加。增加葡萄糖量可促进生物膜形成，而增加CO2和蔗糖则不然，但蔗糖却是导致治疗后口腔内细菌生物膜形成的一个诱发因子［34］。

医疗制品和器械的自身设计以及其保存和使用方式也能影响细菌生物膜的形成。心脏瓣膜假体表面自由能和毛糙程度可影响表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌在其上形成生物膜，而金黄色葡萄球菌生物膜的形成则不受这些因素干扰［35］。血清具有抑制铜绿假单胞菌在医疗器械上形成生物膜的能力，其机制可能有二:首先血清清蛋白可以在物体上形成物理屏障阻止铜绿假单胞菌在物体上的黏附，其次血清某些组份可以提高铜绿假单胞菌的震颤运动使其不能在物体上稳定黏附阻止生物膜形成［36］。血液制品中血小板存在的条件下能够促进表皮葡萄球菌生物膜的形成［34］。静脉插管所用药物可影响生物膜的形成，多巴胺可刺激葡萄球菌在插管上生物膜形成，而多巴酚丁胺和肝素则抑制生物膜形成［37］。

3 控制细菌生物膜感染的方法

3.1 抗生素治疗细菌生物膜感染 细菌生物膜形成不是一蹴而就的，一般需要数天，生物膜在细菌对抗生素的耐受性中起重要作用，细菌形成生物膜后其耐药性可以增加到游离状态的1000倍［38］。为此正确使用抗生素，优选恰当抗生素，改进抗生素治疗细菌生物膜的效果一直是人们关注的焦点和研究的热点。联合使用抗生素或其他药物常能收获单一使用某种抗生素达不到的治疗生物膜感染的效果。联合使用妥布霉素和壳聚糖对游离细菌能达到协同作用效果，而对生物膜内细菌则不然;联合使用妥布霉素和克拉霉素对生物膜内有细菌协同抑制的效果，但却不适用于游离细菌。联合使用妥布霉素和克拉霉素可成功清除细菌生物膜感染如肺囊性纤维化患者的铜绿假单胞菌生物膜慢性感染［39］。单独使用克拉霉素、头孢唑林、万古霉素均不能清除金黄色葡萄球菌生物膜感染，但是克拉霉素联合头孢唑林或万古霉素则可以破坏生物膜，甚至在使用72 h后清除金黄色葡萄球菌感染［40］。多重耐药性铜绿假单胞菌感染是个很难解决的问题，常无法找到行之有效的抗生素治疗方案，喹诺酮类对治疗铜绿假单胞菌生物膜感染常无效，但是用哌拉西林-他唑巴坦包被耳膜插孔所用的硅树脂插管后耐铜绿假单胞菌生物膜没有形成而表现对环丙沙星敏感［41－42］。

针对不同细菌形成的生物膜，选择恰当抗生素也是十分重要的。如达托霉素能够抑制葡萄球菌黏液分泌，阻止生物膜形成，以及破坏黏液成分，降解生物膜结构，在葡萄球菌生物膜形成起始和成熟阶段都起作用，而克林霉素、利奈唑利则不具备以上优点［43］。细菌生物膜表聚糖结构能阻止抗生素进入生物膜杀灭细菌，各种抗生素表聚糖结构渗透性不同，因此应当根据不同的细菌生物膜表聚糖结构选择恰当抗生素。以铜绿假单胞菌生物膜为例，大环内酯类渗透性为100%，喹诺酮类和β内酰胺类＞75%，氨基糖苷类较低［44］。

3.2 非抗生素药物治疗细菌生物膜感染 利用非抗生素药物干扰生物膜形成所需物质合成，如沙雷菌肽酶可显著减少细菌定植物体形成生物膜必需物质黏附素类蛋白的合成，能够抑制李斯特菌形成生物膜侵犯宿主细胞的能力［45］。通过干扰生物膜形成调节机制抑制生物膜形成。密度感应系统是细菌细胞间信号传递的一种方式，往往与生物膜形成紧密相关。一种密度感应系统抑制剂—RNA抑肽不仅自身能够减少医疗器材上的细菌量，而且可以提高抗生素的效力，现已证明联合抗生素使用可以用于控制中心静脉插管相关的葡萄球菌生物膜［46］。

3.3 无菌处理医疗器材，预防生物膜感染 现在抗感染的策略基本仍是快速杀灭游离细菌，而对生物膜内细菌缺乏特异性的清除方法，这也是造成持续感染的原因。虽然目前已经发展出许多针对生物膜内细菌的方法，如分子阻断技术、电促抗感染技术、细菌干扰技术，但是，最好的方法仍旧是无菌处理医疗器材防止细菌定植阻止生物膜形成。常见的方法有使用抗菌物质如银离子、乙二胺四己酸等包被医疗器材，改良导管设计，减少导管给药时间等减少生物膜感染。非热能的处理污染的方法如离子电弧技术能够杀死游离状态、黏附状态甚至是细菌生物膜内的表皮葡萄球菌，可用于不耐热医疗器械的灭菌处理［47］。

4 结 语

在人们重视对细菌生物膜研究和相关学科的发展及研究技术的进步下，生物膜研究取得了长足的进步，许多问题被解决，同样许多问题涌现出来。细菌生物膜的研究仍存在很多未解难题等着科研工作者去破解。

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Advances in the researches of bacterial biofilm infection

SHI De-shireviewing，SHAO Hai-fengchecking
(PLA Institute of Clinical Laboratory Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China)

Biofilms，which are attached to the surface of living or inanimate objects，are bacterial cell structure groups encapsulated by polymers produced by the bacteria themselves.It is estimated that over 80%of human infectious diseases are mediated by biofilms.This article presents an overview on the current characteristics of biofilm research，some factors that affect the mechanism of biofilm formation，and the progress in prevention and control of bacterial biofilm infection.

Bacterial biofilm;Drug-resistance;Infection

Q939.1

A

1008-8199(2011)12-1319-05

南京军区医药卫生“十一五”重点课题(07M089)

210002南京，南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科［施德仕(医学硕士研究生)、邵海枫］

邵海枫，E－mail:shf521201@163.com

2010-11-15;

2011-01-17)

(责任编辑:李风华;英文编辑:李晓军)