家蚕病毒病防治研究进展

邵榆岚，白兴荣，黄 平

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

家蚕病毒病是养蚕生产上最普遍、危害最严重的一类传染性疾病，在各个养蚕季节均可发生，特别是夏秋季节，因环境条件、饲养管理、蚕体体质等因素稍有不慎都可发生病毒病。生产中常见的家蚕病毒病多为核型多角体病、质型多角体病、病毒性软化病、脓核病4类。现将家蚕病毒病防治研究进展介绍如下。

1 早期诊断

不同蚕病都有不同的病症表现，发病时肉眼观察可初步判别其所属蚕病种类，若此时才采取措施阻止蔓延，往往为时已晚，难以控制。因此，早期鉴别诊断是防止家蚕病毒病扩散的有效措施。

1.1 血清学检测技术

在家蚕病毒病的血清学诊断中，用已知抗体检查蚕体内是否存在相应抗原，从而判断蚕是否被某种病毒感染，其优越性就是可以在病毒感染早期作出判别。

限于中国农村经济条件与科学文化水平不高等原因，多数家蚕病毒病诊断方法仅停留在实验室，未能应用于农村生产。目前，根据农村养蚕生产实际条件，时连根等人已制作出简易实用的“家蚕病毒病血清学诊断盒”，选择双向免疫琼脂扩散法并结合混合抗血清，建立了在农村检测诊断家蚕病毒病的方法与技术。它能特异、灵敏、快速地检测诊断出蚕体、蚕室、蚕具中的核型多角体病毒（NPV）、皮质多角体病毒 （CPV）和脓核病毒 （DNV），检出率高达76.5%。不仅能有效预防农村养蚕生产上病毒病的发生流行，而且对大规模开展农村蚕病调查、流行病学研究等都具有重大的实际意义[1]。

1.2 PCR检测技术

PCR又称聚合酶链反应，可在体外使基因组的某个部分短时间内扩增几百万倍，已广泛应用于遗传病诊断、病原体核酸序列、法医学、遗传学鉴定以及癌基因突变研究，并应用于DNA分析和分子克隆[2]，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。近年来，PCR检测技术开始应用于家蚕病毒病检测，涂纳新等人应用PCR技术检测家蚕核型多角体病毒，从患病家蚕血淋巴中抽提总DNA，根据病毒基因组序列设计一对特异性引物在体外扩增，如果产物在琼脂糖凝胶电泳中有特异性条带，则判定为感病。此外，通过感染病毒病的家蚕不同组织中检测出阳性反应时间的不同证明传染途径的不同和发病快慢的不同[3]。PCR检测技术因其成本高，操作不便，在蚕病早期诊断的应用不多，一般只应用于实验室或质检机构。

2 防治方法

2.1 高温治疗

日本学者井上元于1976年对感染病毒病的家蚕进行高温处理，研究其对病毒病的抑制作用。井上之分别用病毒性软化病病毒（FV）和CPV病毒的致死剂量[FV（0.1/ml）和CPV（CP107／ml）]对蚁蚕和4龄起蚕添食接种，27℃饲养并在2～5龄各蜕皮期分别用37℃高温处理，采用各种免疫化学方法研究高温疗效。结果表明，感染FV的家蚕在27℃下饲养，全部发病毙死；经37℃高温处理24h结茧率65%～95%。感染CPV的家蚕以27℃饲养，中肠病变明显，发病毙死。经37℃高温处理24h、48h，有50%蚕结茧；37℃高温处理72h，结茧率高达90%[4]。此外，余国东的研究也表明，高温处理的适期是眠中至蜕皮12h，效果最为显著，可能是因为高温可阻碍细胞质多角体的形成，同时被病毒感染的中肠细胞在幼虫蜕皮期向组织外脱落，从而填补了新生细胞[5]。

2.2 药物添食

2.2.1 抗病毒药剂

从家蚕病毒病的治疗来看，用于临床治疗的药剂并不多，原因可能是抑制病毒增殖的药物对宿主也有毒性，难以实用化。尽管如此，家蚕病毒病的药剂治疗研究还是取得了一定的进展。据报道5-氟尿嘧啶等尿嘧啶代谢类似物可作为抗病毒药剂，有效浓度为5×10-4～5×10-5mol/L的5-氟尿嘧啶可使病毒性软化病的发病率降低20%～30%；9-氨基乳酸吖啶能使核型多角体病的发病率降低30%～60%；烷基化5’-鸟嘌呤核苷酸能使蚕对NPV的抗性提高1000倍以上；萘啶酸铜对家蚕核型多角体病和病毒性软化病的发病率有明显抑制作用，但对质型多角体病无效；胍对病毒性软化病有一定的治疗作用；果糖嗪对核型多角体病、质型多角体病、病毒性软化病的发生有一定的抑制作用。一些对家蚕病毒病治疗有效的药物[6～9]已经投放市场，但在生产实际中却未得到普通认可。

2.2.2 抗菌药物

国内外研究证实，家蚕病毒病的发生与肠道细菌有密切关系。细菌病的发生会导致蚕体虚弱，降低对病毒病的抵抗能力。CPV与肠杆菌能同时感染圆筒状细胞引起发病。FV与细菌混合接种，发病率比单独接种明显增加，单独接种FV发病率很低或不发病，而细菌的存在会明显提高病毒性软化病的发病率。目前有效的应对措施就是使用抗菌素。蚕期中添食诺氟沙星（氟哌酸）对抑制蚕体内细菌的繁殖、降低死亡率和病毒感染率、保持蚕儿发育整齐和推迟发育时间等都有显著效果[10]。以盐酸环丙沙星为主要成分的蚕用盐酸环丙沙星胶囊的预防用量（100mg/kg）和治疗用量（150mg/kg），效果优于氯霉素、红霉素，且使用方便，安全可靠，可作为防治家蚕细菌病的理想药物[11]。朱方容等人在多种抗菌药物比较试验中发现，蚕服康1号的治疗效果最优，其次为新药B[12]。余柳涛等人的试验结果表明，中国农科院蚕业研究所生产的亚迪蚕丰对预防家蚕细菌病的效果比盐酸诺氟沙星好，与盐酸环丙沙星相当[13]。实际上，抗菌素对家蚕病毒病无直接作用，使用不当反而对蚕造成潜在威胁，应避免滥用。

2.3 弱毒苗

弱毒苗是家禽疾病免疫防治用的1种生物制剂。它与强毒苗的根本区别在于前者无传染性，后者有传染性，且使用弱毒苗的原发动物继代数代后不会使弱毒变强，具有产生免疫早、免疫持续期长的特点。同一细胞被2种病毒入侵时，往往产生2种完全不同的结果：一种情况是2种病毒互不相干各自增值，另外一种情况是一种病毒抑制另一种病毒的增殖。第2种现象被称为干扰现象。关于干扰现象的机制，推断是家蚕食下不活化的病毒后，其消化液中或中肠皮膜细胞靠围食膜一面形成抗病毒状的物质，由此抑制病毒的感染，因而病毒病发病率受到抑制[14]。质型多角体病毒不同株系之间存在明显的干扰现象。利用热处理、紫外线照射、甲醛灭活的CPV毒力减弱，给蚕添食后，对活性CPV的感染有干扰作用。用丙内酯或热灭活的NPV给家蚕添食也可获得一定的免疫。弱毒苗要求被接种对象是健康无病的，疫苗应现配现用，使用过程中不断摇动，并且使用疫苗时最好停止使用消毒药物。

2.4 抗病育种

在家蚕各种防病措施中，以提高家蚕本身的抗病能力为目的的抗病育种是最佳的解决途径，能从根本上阻止或减少蚕病的发生。

家蚕的抗病性受基因控制，且受隐性基因控制的感染抵抗性容易导入实用品种中，如蚕对DNV的感染抵抗性多数情况下受隐性基因控制；从生产应用的角度看，受显性基因控制的感染抵抗性应用价值最大，一旦导入实用品种，较稳定且F1代抗病性就得以体现，如某些品种对NPV、CPV的感染抵抗性受显性基因控制。段家龙认为，家蚕对CPV的感染抵抗性受多基因控制，加性效应占主要作用，F1代有杂交优势，有偏父遗传现象[15]。张志芳采用阀性状拟连续性方法研究发现，家蚕对CPV感染抵抗性的基因位点不少于2个，而且是显性效应大于加性效应，并存在超显性现象[16]。钱荷英等试验表明，家蚕对NPV的感染抵抗性存在杂种优势现象，即F1代的抵抗性明显高出两亲本的平均值，而且还高出抗体亲本，呈超显性现象[17]。经典的抗病育种常常采用回交的方法将抗病基因导入实用品种，对于抗病显性基因的导入可以在回交代中添毒筛选。但对于抗病隐性基因常常在回交后自交一代，再通过添毒筛选保留隐形抗病基因[15]。荒武以秋光×龙白的杂种后代为材料，用高浓度的游离NPV病毒注射蛹体，连续经过8代，选育系对NPV蛹体皮下注射感染抵抗性比未选系提高10～100倍[16]。陈克平对中国部分家蚕实用品种和保存种进行抗DNV调查，筛选出8个抗性品种，通过回交的方法将抗病基因导入家蚕实用品种，组配的一代杂交种对DNV全抗，并已达到家蚕实用品种的水平[17]。

传统的抗病育种不仅周期长，添毒筛选准确性差，且容易污染环境。随着分子生物技术的迅猛发展，分子标记技术的出现给家蚕抗病育种工作带来了新的发展契机。目前在家蚕育种分子标记中一般运用RFLP标记（限制性片段长度多态性）、RAPD标记（随机扩增多态性DNA）、AFLP标记（扩增片段长度多态性）。家蚕分子标记辅助育种是分子标记在家蚕育种上的一个重要应用。利用上述分子标记在杂交和回交中追踪特定基因流向，用最短的育种时间和最小的育种规模，达到育种期望。利用分子标记辅助育种的步骤：（1）选择供体亲本和轮回亲本；（2）筛选出期望导入目的基因的分子标记；（3）分析BC1代各个体标记进行保留或淘汰，同样的方法到BC5或BC6代；（4）若选择的目的基因是隐性基因，则采用RAPD即可获得，若选择的目的基因是显性基因，则进行自交，自交后可采用RFLP标记区分3种基因或用RAPD标记选择后代推测上代基因[18]。贺一原、何斯美等用RAPD技术对家蚕抗脓核病近等基因系进行分子标记，获得OPF-062000和OPF-0619002个标记[17]。姚琴、李木旺等进行家蚕抗NPV分子标记研究，获得了与家蚕抗NPV有关的分子标记OPA-18700，并在回交世代中检测验证了其可靠性[20]。

2.5 消毒预防

病毒粒子的存在是家蚕病毒病发生的先决条件。能有效打开病毒多角体，使病毒粒子充分暴露的快捷途径是使用消毒剂。目前常用的杀病毒消毒剂按其主要成分大致分为氯制剂、醛类、表面活性剂和石灰[21]。含氯消毒剂能迅速氧化、破坏病毒衣壳上的酪氨酸，抑制病毒的特异性吸附，阻止其对宿主细胞的感染，生产上一般使用碱性较强的漂白粉，而对于碱性不强或溶液呈弱酸性的优氯净可配合石灰等使用，用于蚕室蚕具的消毒；醛类消毒剂主要与蛋白质中的氨基结合使其变性或使蛋白质分子烷基化，主要有甲醛、戊二醛等制剂，多用于环境消毒；表面活性剂类消毒剂以季胺盐类为主，能迅速渗入胞浆膜脂质和蛋白质体，改变细胞膜通透性，目前主要有蚕季胺Ⅰ号、蚕季胺Ⅱ号和蚕康宁等[22]；石灰是养蚕业最常用又廉价的消毒剂，其强碱性可使病毒多角体外壳迅速溶解，释放出游离病毒而被杀死，对家蚕NPV、CPV有良好预防和控制效果[21]。一般消毒药剂若单剂使用时，稳定性较差，腐蚀性、刺激性强，其应用范围受到限制。近年来，复合配方和新剂型与其他消毒剂的协同作用，提高了消毒效果和稳定性，是当前消毒剂的研究方向。目前，国内有许多有机氯复方剂出现，如二氯异氰尿酸钠复方制剂、三氯异氰尿酸复方制剂等。“安灭杀”消毒剂为戊二醛和专利季胺盐的复方剂，2种成分有相加效果，是消毒剂最佳组合之一[22]。

近年来，臭氧用于消毒杀菌已成为消毒剂行业的新型材料和研究热点，广泛应用于医学、防疫、水处理等方面，但在蚕业生产中应用甚少。有研究报道，采用新生臭氧气流进行局部有针对性的处理家蚕病毒多角体30min后，病毒对家蚕失去感染力，且蚕体生长发育及生理机能无不良反应，进一步研制出1种养蚕专用消毒仪器，臭氧有可能成为蚕桑生产中一种无污染而又高效的绿色消毒剂[23]。

3 展望

家蚕病毒病的防治一直以来都是生产上的重点处理环节，但目前应对措施主要还停留在消毒防病的基础阶段。高温治疗在生产上存在2个问题，一是高温疗法对非包涵体病毒的作用较明显，而对包涵体病毒的效果较差。二是高温疗法所用的温度已超过蚕的适温范围，可能引起蚕体虚弱，发生细菌性肠胃病。所以在实际应用中，最好只针对已早期诊断确定为病毒病的病蚕进行高温处理，以降低病害，减少损失，避免影响健康蚕。

100多年来，家蚕作为实验动物在经典遗传学、动物遗传学、发育生物学、细胞生物学、昆虫免疫学等领域受到广泛关注。随着21世纪科学技术的高速发展，家蚕作为现代生命科学研究的模式生物，在基因组学、人类疾病、发生生物学、医药学、鳞翅目病虫害以及环境监测等领域具有更重要的研究价值。

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