PTEN基因对血管平滑肌细胞影响的研究进展

胡晓蔚(综述)，方五旺(审校)

(皖南医学院，安徽 芜湖241000)

1977年，Andreas Grüntzing第一次应用经皮冠状动脉腔内成形术治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病，然而术后再狭窄问题在一定程度上影响了其远期疗效，发生率高达30%～50%，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是血管壁的主要成分，其增殖及迁移在血管成形术后的再狭窄过程中起重要作用。在药物洗脱支架时代再狭窄发生率仍可达5% ～ 10%［1，2］。近 年 来，随着分子生物学技术的飞速发展，人们对再狭窄的认识已深入到基因水平、基因治疗，尤其是控制VSMC增殖和迁移的相关基因治疗，在当前是一个重要的研究方向。其有可能成为21世纪血管性疾病的一种新的、更有潜力的治疗方法。

1 再狭窄机制

VSMC的增殖和迁移是血管成形术后再狭窄发生的最重要机制［3］。Curcio等［4］认为支架的置入机械损伤引发一系列的反应:内皮损伤、血管内膜下的成分暴露;随后血小板激活，在损伤部位沉积形成血栓，另外，脂质的渗透使巨噬细胞聚集，两者共同释放细胞因子、有丝分裂原、趋化因子、血小板源性生长因子、凝血酶、β生长因子、表皮生长因子等;再者血管损伤后引起肿瘤坏死因子、白细胞介素、趋化因子、基质金属蛋白酶、血管紧缩素释放增多，三者共同引起VSMC开始增殖，同时VSMC增殖也促进肿瘤坏死因子、白细胞介素、趋化因子、基质金属蛋白酶、血管紧缩素释放增多，随着时间的推移，支架置入后的再狭窄逐渐形成。

由于血管重建术中的血管损伤刺激多种生长因子的复合作用而诱导VSMC的增殖和迁移，进而引起内膜增厚。其病理性增殖主要体现在其表型的转变，即平滑肌细胞从收缩型向合成型的转变，表现为复制能力增加，几乎无收缩能力。中层平滑肌细胞的增殖在血管中膜平滑肌损伤后立即发生，48 h达到高峰，平均4 d，增殖的中层平滑肌细胞通过内弹力膜的网状孔间隙迁移到内膜，进一步增殖肥大，并由收缩表型转变为合成表型。在损伤后2个月左右增殖、肥大的平滑肌大量合成，分泌细胞外基质，引起内膜进一步增厚［5］。从基因治疗角度调控VSMC的增殖和迁移，是防治再狭窄的一个重要方面。

2 PTEN基因的结构及作用机制

PTEN基因由多功能磷酸酶编码，是3个研究小组于1997年发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因。他们从蛋白结构特征﹑在肿瘤中的突变及调节表达等3个领域进行研究，分别将其命名为PTEN基因，多发性进展期癌突变基因(mutation in multiple advanced cancer 1，MMAC1)和由转化生长因子β1调节的、上皮细胞富含的磷酸酶基因(TGF-β1regulated and epithelial cell-riched phosphatase，TEP1)。在比较三个基因的cDNA和编码的蛋白质后证实PTEN/MMACl/TEP1三者为同一种基因。近年来，该基因已成为研究的热点，也成为今后基因治疗的又一潜在途径。

2．1 PTEN基因的结构 PTEN基因是迄今发现的唯一具有蛋白酯酶和磷酸酶活性的抑癌基因，由N端的磷酸酶结构域、C2结构域及C端的尾部结构域组成。PTEN基因定位于人类染色体10q23，全长218 kb，含有9个外显子和8个内含子，mRNA长度为5500 bp;5'端有804个核苷酸的非翻译区，其后有长度为1209个核苷酸组成的开放阅读框架，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。PTEN基因的N末端是主要结构功能区，第5个外显子的第122～133位氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)编码，与蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶催化中心高度同源，典型氨基酸序列为HCXXGXGRXG，表明该区域具有蛋白酪氨酸磷酸酶和双特异性磷酸酶的功能，是PTEN发挥肿瘤抑制活性的功能区［6］。C2结构域与磷酸酶结构域之间有密切的接触面，两者共同组成催化单位，如剪除C2结构域C端少数残基可使磷酸酶活性完全丧失。C端虽无磷酸酶活性，但对维持PTEN蛋白空间结构的完整性起着重要作用，C端突变的PTEN将失去磷酸酶活性［7］。

2．2 PTEN基因的作用机制 PTEN基因在细胞周期调控、细胞凋亡、黏附和迁移、血管内皮细胞增殖和肿瘤微血管形成及维护免疫系统的稳定等多种生理活动中发挥重要作用［8，9］。其作用机制尚未完全清楚，还有待于进一步研究，在此主要叙述以下3个途径。

2．2．1 磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3)途径 研究发现纯化的PTEN能使PIP3脱磷酸而转变为磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-triphosphate，PIP2)，而 突 变 型PTEN则引起PIP3的积聚;确立了PIP3是PTEN的重要的生理性底物。PIP3是一些生长因子如胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子信号的第二信使，它激活的信号有助于细胞生存、抑制细胞调亡，其通过脱磷酸作用使PIP3转变为PIP2，而抑制其活性，阻断PIP3/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信号转导通路。PTEN通过以下途径发挥作用:①阻断 PIP3/PKB信号通路，抑制细胞生存，促进细胞凋亡。PKB在调控细胞生存/凋亡中发挥关键作用，其激活可抑制凋亡信号，如使β1连锁蛋白积聚、糖原合成激酶3磷酸化而失活，使凋亡前蛋白BAD(Bcl-2家族成员)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9磷酸化以抑制BAD与Bcl-xL(Bcl-2家族成员)的结合，同时上调生存信号。PTEN使PIP3脱磷酸而阻断磷脂酰肌醇3位羟基激酶(phos phatidylinositide 3-OH kinase，PI3K)/PKB信号通路，使PKB活性下降，从而使PKB介导的提高细胞生存的效应发生逆转而促进细胞凋亡。②抑制PI3K/磷脂酞肌醇依赖的激酶1信号通道，调节蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化，从而抑制细胞分裂和增殖。PKC信号转导通路是细胞内一促细胞分裂、增殖途径，其是一效应依赖的激酶，但其磷酸化途径仍不十分清楚。目前的研究表明与PI3K有关，PKC的磷酸化可能通过依赖PI3K/磷脂酞肌醇依赖的激酶1的信号途径［10-12］。

2．2．2 局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)途径 FAK是一种胞内非受体酪氨酸激酶，其调控的主要模式是通过整合素介导的黏附于细胞外基质而被活化，使FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加了其磷酸激酶的活性，FAK再作用于丝氨酸苏氨酸激酶和磷酸酶，最终导致FAK去磷酸化而失活，从而阻断FAK对丝裂原活化的蛋白激酶的调节，抑制细胞的增殖、浸润及迁移等［13］。研究发现，PTEN基因通过负向调控黏附过程和直接去磷酸化降低FAK及其下游信号分子p130Cas(p130 Crk-associated substance)酪氨酸磷酸化水平，从而抑制细胞的浸润、转移;也可以通过FAK去磷酸化来抑制PI3K的活性，从而抑制PI3K/PKB通路。

2．2．3 丝裂原激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径 MAPK代表一个激酶家族，MAPK的活化是通过一个特殊的苏氨酸和酪氨酸磷酸化来实现。MAPK的级联反应将信号由细胞表面传递至细胞核，并根据所接受的刺激或涉及的信号途径的不同来调节细胞增殖、分化和凋亡。PTEN主要抑制胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，和抑制 MAPK上游MAPK/ERK激酶、Ras蛋白的活化及连接蛋白Shc(是通过cDNA克隆筛选到的编码SH结构域的基因的蛋白产物)的磷酸化而促进细胞凋亡。Kang-Park等［14］发现，PTEN通过其磷酸酶活性使得PKC、MAPK、MAPK激酶去磷酸化失活，阻断胰岛素样生长因子信号途径，最终诱导肝细胞瘤发生凋亡。而PTEN依赖性细胞凋亡可由下游分子 PKB的表达而挽救。2001年，Weng等［15］的研究结果显示，PTEN主要通过MAPK依赖性胰岛素反应途径抑制体外乳腺癌细胞模型生长。此后他们进一步研究PTEN在乳腺癌细胞株MCF7中的作用时发现，PTEN能有效阻断胰岛素介导的癌基因ETS-2(E-Twenty-Six-2，ETS家族成员)的磷酸化作用，而PTEN的这种阻断作用在于抑制MAPK家系中的ERK簇，并不影响PKB调控途径。此外，在某些细胞系中，PTEN依赖性细胞凋亡不可能由PI3K之上游分子表达来获救，这与PTEN在PIP3水平负调控PI3K/PKB通路相一致。

3 PTEN基因对血管成形术后再狭窄的影响

PTEN基因具有调节细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞生长、侵袭转移等主要功能，还在胚胎的生长、发育，细胞黏附和迁移、细胞分化、细胞衰老与凋亡、维护免疫系统的稳定等多种生理活动中发挥重要作用［8，9］。目前关于 PTEN在肿瘤的发生发展中研究较多，而在心血管疾病方面还需要大量的实验对它的作用及其调控机制进行研究。有证据表明，PTEN显著抑制损伤后VSMC向伤口的迁移。Schwartzbauer等［16］报道，增加重组腺病毒PTEN基因表达能提高半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3活性和裂解多腺苷二磷酸多聚酶，从而诱导原代新生鼠心肌细胞的凋亡，同时阻断经PI3K途径的信号;并发现心肌细胞的肥大同时伴有PKB活性的增加。Dimmeler等［17］报道PTEN基因作用上游的重要增殖信号转导通路，如磷酸肌醇依赖性激酶的激活，阻断磷脂结合 PKB活化所必需的结构域，从而抑制VSMC增殖和迁移，增加诱导细胞凋亡。Huang等［18］通过腺病毒体外转染使兔VSMC过表达PTEN，抑制血小板衍生生长因子、核糖体蛋白质S6激酶、PKB的磷酸化和糖原合酶激酶3α和β，调控VSMC增殖与迁移。Selvendiran等［19］研究发现，在体外人主动脉VSMC和体内大鼠颈动脉球囊损伤模型中，由HO-3867(一种新合成的类姜黄色素)通过上调PTEN的表达调控抑制VSMC增殖和血管再狭窄，HO-3867通过上调PTEN表达和下调基质金属蛋白酶、核因子κB蛋白，抑制动脉内膜的增生。Huang等［20］使用大鼠颈动脉球囊损伤，然后用重组腺病毒介导的PTEN基因转染至大鼠颈动脉，证明了PTEN基因过表达抑制内膜增生、诱导细胞凋亡和抑制中膜细胞增殖，主要是通过调节抑制PI3K。Mourani等［21］研究比较胚胎鼠、颈动脉球囊损伤和不做颈动脉球囊损伤的大鼠后PTEN的表达发现，PTEN的活性降低，能抑制体内VSMC的增长率，其机制也主要是负性调控体内的PI3K信号。Garl等［22］在动物颈动脉球囊损伤的模型中，研究了基底膜蛋白多糖和PTEN基因在VSMC生长规律的相关性，证明了基底膜蛋白多糖介导PTEN基因活性可以抑制VSMC增殖，并用免疫组织法测定假手术和球囊损伤颈动脉组织中时间对PTEN蛋白表达的影响，PTEN蛋白总含量在动脉血管损伤内膜增长检测到水平显著升高。与此相反，假手术组PTEN蛋白检出率相应较低。在术后第2天，VSMC内膜中可以检测到磷酸化PTEN蛋白，术后4～10 d，大量的磷酸化PTEN蛋白在内膜检测出，术后14 d，磷酸化PTEN蛋白表达大大减少，而且术后28 d几乎检测不到。Koide等［23］在动脉内膜损伤部位的注射腺病毒介导的PTEN和腺病毒介导的乳糖操纵子Z基因进行比较，14 d后组织病理学检测发现，腺病毒介导的PTEN组较对照组相比能够明显减少新内膜形成，减少细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能部分通过抑制炎性反应，包括抑制巨噬细胞的侵入和炎性因子的表达。

4 小结及展望

PTEN基因的发现被认为是抑癌基因研究领域的又一重要里程碑。PTEN的存在、发现与研究给心血管疾病诊治带来新的思路、线索甚或是突破。目前关于PTEN基因在心血管疾病方面的研究较少，还需要大量的实验对它的作用及其调控机制进行研究。相信随着研究的不断深入，将会更清楚PTEN基因在心血管疾病防治中的作用，为基因治疗提供新的思路，PTEN的研究仍任重道远。

［1］ Vassilev D，Doganov A，Gil RJ．The role of angiotensin receptor 1 blockers in restenosis prevention after percutaneous coronary inter-ventions［J］．Kardiol Pol，2010，68(1):97-101．

［2］ Merkely B，Jambrik Z．Drug-eluting balloon in the treatment of a recurrent in-stent restenosis of drug-eluting stent［J］．Orv Hetil，2010，151(37):1509-1514．

［3］ Brown DA，Lee EW，Loh CT，et al．A new wave in treatment of vascular occlusive disease:biodegradable stents--clinical experience and scientific principles［J］．Vasc Interv Radiol，2009，20(3):315-324．

［4］ Curcio A，Torella D，Indolfi C．Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting:approach to therapy［J］．Circ J，2011，75(6):1287-1296．

［5］ Min SK，Kenagy RD，Clowes AW．Induction of vascular atrophy as a novel approach to treating restenosis［J］．Vasc Surg，2008，47(3):662-670．

［6］ McCall P，Witton CJ，Grimsley S，et al．Is PTEN loss associated with clinical outcome measures in human prostate cancer［J］．Br J Cancer，2008，99(8):1296-1301．

［7］ Manna D，Bhardwaj N，Vora MS，et al．Differential roles of phosphatidylserine，PtdIns(4，5)P2，and PtdIns(3，4，5)P3 in plasma membrane targeting of C2 domains．Molecular dynamics simulation，membrane binding，and cell translocation studies of the PKCalpha C2 domain［J］．Biol Chem，2008，283(38):26047-26058．

［8］ Ni Z，Tang J，Cai Z，et al．A new pathway of glucocorticoid action for asthma treatment through the regulation of PTEN expression［J］．Respir Res，2011，12(1):47．

［9］ Hill R，Wu H．PTEN，stem cells，and cancer stem cells［J］．J Biol Chem，2009，284(18):11755-11759．

［10］ Fan C，He L，Kapoor A，et al．PTEN inhibits BMI1 function independently of its phosphatase activity［J］．Mol Cancer，2009，8(1):98．

［11］ Cid VJ，Rodríguez-Escudero I，Andrés-Pons A，et al．Assessment of PTEN tumor suppressor activity in nonmammalian models:the year of the yeast［J］．Oncogene，2008，27(41):5431-5442．

［12］ Kortholt A，Bolourani P，Rehmann H，et al．A Rap/phosphatidylinositol 3-kinase pathway controls pseudopod formation［J］．Mol Biol Cell，2010，21(6):936-945．

［13］ Lan H，Zhong H，Gao Y，et al．The PTEN tumor suppressor inhibits human airway smooth muscle cell migration［J］．Int J Mol Med，2010，26(6):893-899．

［14］ Kang-Park S，Lee YI，Lee YI．PTEN modulates insulin-like growth factorⅡ(IGF-Ⅱ)mediated signaling;the protein phosphatase activity of PTEN downregulates IGF-Ⅱexpression in hepatoma cells［J］．FEBS Lett，2003，545(223):203-208．

［15］ Weng LP，Brown JL，Baker KM，et al．PTEN blocks insulinmediated ETS-2 phosphorylation through MAP kinase，independently of the phosphoinositide 3-kinase pathway［J］．Hum Mol Genet，2002，11(15):1687-1696．

［16］ Schwartzbauer G，Robbins J．The tumour suppressor gene PTEN can regulate cardiac hypertrophy and survival［J］．Biol Chem，2001，276(38):35786-35793．

［17］ Dimmeler S，Zeiher AM．PTEN-uating Restenosis［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(5):715-716．

［18］ Huang J，Kontos CD．Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation，migration，and survival by the tumor suppressor protein PTEN［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(5):745-751．

［19］ Selvendiran K，Kuppusamy ML，Bratasz A，et al．Inhibition of Vascular Smooth-Muscle Cell Proliferation and Arterial Restenosis by HO-3867，a Novel Synthetic Curcuminoid，through Up-Regulation of PTEN Expression［J］．J Pharmacol Exp Ther，2009，329(5):959-966．

［20］ Huang J，Niu XL，Anne M，et al．Adenovirus-Mediated Intraarterial Delivery of PTEN Inhibits Neointimal Hyperplasia［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(2):354-358．

［21］ Mourani PM，Garl PJ，Wenzlau JM，et al．Unique，highly proliferative growth phenotype expressed by embryonic and neointimal smooth muscle cells is driven by constitutive Akt，mTOR，and p70S6K signaling and is actively repressed by PTEN［J］．Circulation，2004，109(10):1299-1306．

［22］ Garl PJ，Wenzlau JM，Walker HA，et al．Perlecan-induced suppression of smooth muscle cell proliferation is mediated through increased activity of the tumor suppressor PTEN［J］．Circ Res，2004，94(2):175-183．

［23］ Koide S，Okazaki M，Tamura M，et al．PTEN reduces cuff-induced neointima formation and proinflammatory cytokines［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(6):2824-2831．