高效液相色谱法测定三叶委陵菜中β-谷甾醇含量

邓凤玲

(武汉市汉口医院药剂科，430012)

三叶委陵菜(Protentilla Freyniana Bornm)为多年生草本植物，其根茎或全草入药，味苦涩，具清热、解毒、凉血、镇痛之功效，可用于治疗骨结核、口腔炎、跌打损伤、外伤出血等［1-2］。三叶委陵菜中含有多种甾体化合物，其中β-谷甾醇(β-sitosterol)为主要活性成分之一［3-4］。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对 β-谷甾醇进行测定，方法简便，分离结果令人满意，重复性好，可为三叶委陵菜的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪(单元泵，手动进样器，紫外检测器，柱温箱，变色龙工作站)，β-谷甾醇(中国药品生物制品检定所，批号:110851-200708)，三叶委陵菜根茎于2009年7月采自江西省庐山，由华中科技大学同济医学院药学院生药系陈家春教授鉴定，粉碎成粒径0.250～0.425 mm(40～60目)粉末，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-水(96∶4)，检测波长210 nm，流速1.2 mL·min-1，进样量:20μL，柱温:30℃。

2.2 检测波长的确定 取β-谷甾醇对照品适量，加流动相制成每毫升含β-谷甾醇10μg的溶液，经紫外全波长扫描，结果在206 nm波长处有最大吸收，但流动相在此有末端吸收，不适宜做检测波长，因210 nm离最大吸收处最近，避开流动相末端吸收，故以210 nm为检测波长。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取β-谷甾醇对照品10.12 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品储备液。

2.4 样品溶液的制备 取三叶委陵菜根茎粉末样品约1.0 g，精密称定，精密量取并加入甲醇10 mL，精密称定质量，超声处理15 min，放置至室温，加甲醇补足损失的质量，过滤，续滤液为供试品溶液。

2.5 方法专属性 分别吸取β-谷甾醇对照品储备溶液、供试品溶液各20μL，进样，按上述色谱条件进样检测，可见β-谷甾醇对照品、供试品约在13 min出现β-谷甾醇特征吸收峰，可达到基线分离。

2.6 标准曲线的绘制 分别精密吸取β-谷甾醇储备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，以流动相定容至10 mL，摇匀，得到浓度分别为 40.48，80.96，121.44，161.92，202.40μg·mL-1的β-谷甾醇对照品溶液，按上述色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线为:Y=0.048 7X-0.512 7，r=0.999 8，β-谷甾醇线性范围为 40.48 ～202.40 μg·mL-1。

2.7 稳定性实验 取供试品溶液在0，1，2，4，8，12 h分别进样测定，结果基本一致，其RSD为1.45%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 精密度实验 精密吸取浓度为121.44μg·mL-1的对照品溶液20μL，在上述相同色谱条件下连续进样5次，测得峰面积的RSD为1.27%。

2.9 重复性实验 取同一批样品5份，精密称定，制成供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定β-谷甾醇含量，平均含量0.18%，RSD为1.24%。

2.10 回收率实验 分别精密称取已知含量的粉末样品(批号:090712)约0.5 g，精密加入适量的β-谷甾醇对照品，按供试品溶液的制备法制备样品溶液9份。依次进样，平均回收率为98.11%，RSD为1.36%。见表1。

表1 β-谷甾醇加样回收率实验结果

2.11 样品测定 分别精密称取3批样品，按上述样品溶液的制备法制备样品溶液，依上述方法操作，记录色谱峰面积，用标准曲线法计算其含量。结果见表2。

表2 3批样品中β-谷甾醇含量测定结果 n=3

3 讨论

笔者在本研究建立的高效液相色谱法对三叶委陵菜有效成分β-谷甾醇的含量测定有较好的精密度和准确度。β-谷甾醇无紫外吸收，采用低波长进行检测，无需衍生化，结果令人满意［5］。

通过以上结果可以看出，三叶委陵菜中β-谷甾醇的含量超过千分之一，本方法灵敏、准确，可以为三叶委陵菜质量控制提供参考。

［1］ 江苏新医学院.中药大辞典(上册)［M］.上海:上海科学技术出版社，1977:69-70.

［2］ 刘梁，韩定献，周军，等.三叶委陵菜根中三萜类化合物抗病毒作用研究［J］.时珍国医国药，2006，17(8):1484-1485.

［3］ 蔡玉华，刘梁，韩丁献，等.三叶委陵菜根化学成分的研究［J］.武汉理工大学学报，2005，25(9):32-33.

［4］ 刘新国，魏元锋，韩建伟，等.正交实验法优选三叶委陵菜渗漉提取的工艺条件［J］.医药导报，2007，26(6):652-654.

［5］ 吴家红，徐文芬，文雯，等.HPLC法测定秋海棠属药材中β-谷甾醇的含量［J］. 微量元素与健康研究，2009，26(6):24-26.